研究背景近年来,随着人口老龄化、糖尿病和高血压发病率的上升,慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)发病率逐年升高,已成为日益严重的全球性健康问题,在发达国家及发展中国家均会造成不良结局。研究显示,全球一般人群CKD患病率已高达14.3%,中国18岁以上人群CKD患病率高达10.8%,而在大于60岁的老年人群中患病率更高。且CKD的患病率呈现出不同经济地域差距,最近统计研究显示中国乡村地区CKD的患病率高达16.4%。CKD患者在进入透析之前更多的合并心血管疾病(cardiovascular disease,CVD),甚至很多CKD患者在尚未进展至终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)时就死于CVD。CKD患者常被诊断为存在血管钙化(vascular calcification,VC),且随着肾功能下降发生率明显升高,是CKD合并CVD和死亡的高风险因素。有研究显示VC在CKD-5期透析患者的患病率高达80～90%,明显高于CKD-3期患者40%的发病率。一项通过对中国CKD患者VC的流行病学研究显示,中国透析人群总VC患病率为77.4%。而最近一项对151例CKD4-5期非透析患者的研究结果显示,腹主动脉钙化(abdominal aortic calcification,AAC)的患病率为73%,其中47%有严重钙化。在维持性血液透析非糖尿病患者心脏瓣膜钙化(cardiac valve calcification,CVC)的发生率达到 70%,提示 VC 在 CKD 患者中普遍存在;而AAC的程度是CKD非透析患者发生心血管事件的独立风险因素。因此早期识别VC并对影响VC的因素及早干预对改善CKD患者的预后具有重要意义。研究显示VC是一细胞调控的病理过程,包括许多钙化抑制因素及促成因素综合作用的结果。体内、体外的研究均证实klotho在减轻VC的过程中起着关键作用。血清可溶性klotho(sklotho)蛋白己被证明具有保护内皮细胞、避免高磷酸盐和氧化应激对内皮细胞损伤的作用,并阻断由高磷酸盐诱导的平滑肌细胞向成骨细胞的转化;还有研究证实sklotho可以直接抑制血管平滑肌细胞对磷酸盐的吸收,从而抑制VC的发生。血清sklotho对血液透析或腹膜透析患者AAC及CVC的预测价值已经被多项研究证实。而关于血清sklotho与CKD患者预后的研究仍存在有争议的观点;并且既往VC与血清sklotho相关性研究多集中在透析患者人群或CKD3-5期患者。CKD1-5期非透析患者人群VC的发生率及其相关影响因素研究较少,尤其是对CVC在CKD非透析患者中研究不多。血清sklotho水平在CKD1-5期非透析患者中的变化及其与VC的关系尚不明确,血清sklotho能否作为CKD非透析患者早期诊断VC及判断其预后发展的生物标志物尚不清楚。为此本研究以CKD1-5期非透析患者作为研究对象,进行前瞻性观察性研究。研究目的1.观察CKD1-5期非透析患者VC的患病率,探讨血清sklotho与VC发生及其严重程度的关系,分析血清sklotho对VC的预测价值;2.探讨血清sklotho对CKD非透析患者发生急性非致死性心血管事件、开始肾脏替代治疗及AAC评分增加等不良事件的预后影响。研究方法1.研究对象纳入、排除标准按照医院ICD-10疾病编码系统,选取2014年1月至2016年12月在临沂市人民医院肾脏科门诊及住院的CKD1-5期非透析患者。纳入标准:1.主要诊断符合ICD-10疾病编码的CKD1-5期诊断标准;2.CKD病史≥6个月。排除标准:1.年龄小于18岁;2.曾行肾移植手术;3.入选时存在严重心脑血管事件;4.存在急性感染情况;5.存在外周血管疾病或心脏瓣膜病。所有入选者均签署经医院伦理委员会批准的知情同意书。2.临床资料收集及生化指标检测 收集入选者基线水平的人口统计学资料,包括年龄、性别、原发病、CKD病史时间、吸烟史、饮酒史、服药史等临床资料,以问卷调查方式获得,必要时通过查询门诊及住院资料并访谈患者进一步证实。所有入选者过夜禁食8～10小时后,于清晨空腹留取血标本及尿液标本。血标本离心后留取血清,-20℃低温冰箱保存。自动生化分析仪(罗氏Cobas,8000)检测血钙(Ca)、血磷(P)、血清碱性磷酸酶(ALP)、血清白蛋白、血肌酐、血尿素氮、总胆固醇、甘油三脂、血尿酸、C-反应蛋白(CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)等。酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清sklotho(美国R&D)、成纤维细胞生长因子23(FGF23)、全段甲状旁腺激素(iPTH)水平;放射免疫法检测1,25-二羟维生素D3(1,25(OH)2VitD3)水平。留取清洁中段尿l0ml于尿杯中,半小时内送检检测尿微量白蛋白与肌酐比值(ACR)。3.血管钙化的评估3.1腹主动脉钙化(AAC)检测及钙化程度确定入选者均接受腹部侧位X线平片检查(空腹,仪器:SIEMENS FD-X),由两位有经验的放射科医师采用盲法分别独立阅片并评分,两位医师对不一致结果重复阅片并取得一致意见后进行统计分析。半定量积分法对患者第1节至第4节腰椎对应的AAC情况进行评分。评分方法:根据腹主动脉前壁和后壁钙化斑块的长度分别给予0-3分的评分(0分:无钙化;1分:钙化范围<1/3的动脉壁长度;2分:钙化范围累及1/3-2/3的动脉壁长度;3分:钙化范围>2/3的动脉壁长度)。根据积分范围确定患者钙化程度:轻度钙化(0<AAC评分<5);中度钙化(5≤AAC评分≤15);重度钙化(AAC评分≥16)。3.2心瓣膜钙化(CVC)检测及钙化程度确定心脏彩超仪器为飞利浦EPIQ7,探头频率2.5～3.5MHZ。由一名有经验的心脏彩超医师评估瓣膜钙化情况;心脏病专家证实了所有的超声心动图结果。当探及心脏瓣膜处超过1mm的强回声则视为瓣膜钙化;瓣膜钙化定义为主动脉瓣膜、二尖瓣瓣膜或瓣环出现1个或多个>1mm的强回声折射。根据钙化面积分为3个等级:轻度瓣膜钙化:只有一个孤立的区域钙化;中度钙化:有多个区域钙化;重度钙化:钙化广泛而且弥漫性。4.分组标准4.1根据入选者基线肾小球滤过率(eGFR)分5组Ⅰ组(CKD-1期):eGFR≥90ml/min/1.73m2;Ⅱ组(CKD-2 期):eGFR 60～89 ml/min/1.73m2;Ⅲ组(CKD-3期):eGFR 30～59 ml/min/1.73m2;Ⅳ组(CKD-4 期):eGFR 15～29 ml/min/1.73m2;V组(CKD-5期):eGFR<15 ml/min/1.73m2非透析患者。按慢性肾脏病流行病学合作组(chronic kidney disease epidemiology collaboration,CKD-EPI2009)公式计算估算肾小球滤过率(eGFR)。4.2根据入选者基线血清sklotho水平中位数及上下四分位数分为4组Ⅰ组:sklotho<Q1;Ⅱ组:Q≤sklotho<Q2;Ⅲ组:Q2≤sklotho<Q3;Ⅳ组:sklotho≥Q3。5.随访 对所有入选者按照血清sklotho四分位数分组进行随访,随访时间2年(24月),每月随访一次。随访方式:电话随访、查询门诊及住院病案资料等。随访内容:(1)记录随访过程中的不良事件:非致死性急性心血管事件(急性冠脉综合征、充血性心力衰竭、心律失常等);开始肾脏替代治疗;详细记录各项不良事件发生的具体时间(月),患者发生多起心血管事件时,只记录第一次事件的时间。(2)记录患者一般情况,根据病情给予健康指导,常规降压、纠正贫血、纠正钙磷代谢紊乱等治疗。随访终点:全因死亡或者开始肾脏替代治疗。已完成24个月随访的入选者随访结束后1周内再次腹部侧位平片检查,并进行AAC评分,评估是否为AAC评分增加。AAC增加定义为随访前后两次X线平片检查发生新的钙化或原有AAC评分增加。6.统计分析 应用SPSS25.0软件进行数据的分析处理。所有假设检验使用显著性水平为0.05的双侧检验。计量资料符合正态分布采用x±s描述,组间比较采用单因素方差分析或独立样本t检验;非正态分布的计量资料采用中位数和四分位数间距M(Q1～Q3)表示,组间比较采用秩和检验。计数资料用率或构成比表示,计数资料的组间比较用卡方(x 2)检验或Fisher确切概率法。变量间相关分析,根据研究目的和资料类型分别采用Pearson相关系数、Spearman相关系数、点二系列相关分析等。采用二分类和有序多分类logistic回归,筛选影响AAC、CVC发生及其严重程度的危险因素。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析 sklotho 对 AAC 是否发生的预测价值。无不良事件累积生存率的估计采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用Log-rank检验。借助Cox比例风险回归模型分析发生不良事件的危险因素。P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.入选者人口学及临床特征 符合入选标准980例,经电话或面谈同意入选本研究的有475例,排除肾移植23例,急性感染(皮肤、呼吸道、消化道、泌尿道等)87例,严重心脑血管病70例,外周血管病24例。确定271例入选者进入本研究,中间因不能完成相关指标采集而退出20例,最终完成本研究共计251例。包括 CKD-1 期 38 例,CKD-2 期 52 例,CKD-3 期 64 例,CKD-4 期 40 例,CKD-5期非透析57例。其中男158(62.95%)例,女93(37.05%)例。入选者年龄(20～86)岁,中位年龄45(34～61)岁。CKD病史时间:6(3.5～11.5)年。有饮酒史 96(38.25%)例,吸烟史 67(26.69%)例。原发病情况:慢性肾小球肾炎108(43.03%)例,其中44(40.74%)例肾穿刺证实,分别为局灶节段硬化性肾炎(FSGS)16(36.36%)例、IgA肾病16(36.36%)例、系膜增生性肾炎12(27.28%)例。糖尿病肾病60(23.90%)例,其中9(15%)例肾穿刺证实。肾病综合征36(14.34%)例,有30(83.33%)例肾穿刺,其中膜性肾病17(56.67%)例、微小病变肾病6(20%)例、系膜增生性肾炎3(10%)例,局灶节段硬化性肾炎(FSGS)4(13.33%)例。高血压肾损害22(8.76%)例,其中3(13.64%)例肾穿刺证实。间质性肾炎8(3.19%)例,其中6(75%)例肾穿刺证实,多囊肾病7(2.79%)例,其它原因10(3.98%)例。共有146(58.17%)例入选者服用降压药物,CKD1-5期服用降压药的例数分别为 9(23.68%)例、14(26.92%)例、39(60.94%)例、37(92.50%)例、47(82.46%)例。有118(47.01%)例入选者服用含钙磷结合剂,CKD1-5期服用含钙磷结合剂的例数分别为10(26.32%)例、12(23.08%)例、28(43.75%)例、27(67.50%)例、41(71.93%)例。有100(39.84%)例患者服用活性维生素D,CKD1-5期服用活性维生素D的例数分别为2(5.26%)例、4(7.69%)例、32(50%)例、27(67.50%)例、35(61.40%)例。有87(36.66%)例入选者使用促红细胞生成素(EPO),CKD1-5期使用EP0的比例分别为0(0%)例、2(3.85%)例、18(28.13%)例、18(45%)例、49(85.96%)例,差异具有统计学意义(P<0.001)。按eGFR分组的各组血清sklotho水平存在显著差异(P<0.001)。组间比较,经过Bonferroni校正后,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组血清sklotho水平显著低于Ⅰ组,差异具有这统计学意义(P<0.05);Ⅳ、Ⅴ组之间血清sklotho水平没有差异(P>0.05)。2.基线水平按eGFR分组的各组AAC和CVC患病率情况251例入选者共有54(21.51%)例存在AAC。CKD1-5期AAC患病率分别为5.26%、7.69%、20.31%、27.50%、42.11%。组间比较,经过 Bonferroni 校正后,CKD-5 期 AAC 的患病率高于 CKD1、2 期(P<0.05)。独立样本 Kruskal-Wallis检验显示CKD-5期AAC评分明显高于CKD1-3期患者,差异具有统计学意义(P<0.001)。入选者共有52(20.72%)例存在CVC。CKD1-5期CVC患病率分别为2.63%、11.54%、16.63%、30.00%、40.35%。组间比较,经过 Bonferroni 校正后,CKD-5期CVC的患病率显著高于CKD1-3期,CKD-4期CVC患病率高于CKD-1期(P<0.05)。3.血清sklotho与其它指标的相关性分析3.1与连续变量之间相关分析结果 血清sklotho与年龄(r=-0.562,P<0.001)、CKD病史时间(r=-0.497,P<0.001)、BMI(r=-0.128,P=0.042)、FGF23(r=-0.898,P<0.001)、血尿酸(r=-0.557,P<0.001)、血磷(r=-0.669,P<0.001)、ALP(r=-0.221,P<0.001)、Hcy(r=-0.264,P<0.001)、iPTH(r=-0.777,P<0.001)、甘油三脂(r=-0.135,P=0.032)、CRP(r=-0.243,P<0.001)呈负相关关系;与eGFR(r=0.824,P<0.001)、HCT(r=0.621,P<0.001)、Hb(r=-0.699,P<0.001)、血钙(r=0.607,P<0.001)、1,25(OH)2-VitD3(r=0.598,P<0.001)呈正相关关系;与尿ACR(r=-0.031,P=0.628)、白蛋白(r=-0.112,P=0.077)、总胆固醇(r=-0.026,P=0.681)没有相关关系。3.2与二分类变量之间点二系列相关分析结果 血清sklotho与性别没有相关关系(r=-0.043,P=0.502);与饮酒史(r=-0.269,P<0.001)、吸烟史(r=0.269,P<0.001)存在正相关关系;与服用降压药(r=-0.0505,P<0.001)、服用含钙磷结合剂(r=-0.P<0.001)、服用活性维生素D(r=-0.515,P<0.001)、使用EP0(r=-0.667,P<0.001)等存在负相关关系;与 AAC(r=-0.303,P<0.001)及CVC(r=-0.301,P<0.001)存在负相关关系。3.3与等级变量秩相关分析结果血清 sKlotho 与 AAC(r=-0.330,P<0.001)和 CVC(r=-0.301,P<0.001)的严重程度存在较弱的负相关关系。4.基线水平二分类logistic回归分析影响AAC及CVC是否发生的因素将AAC的发生与否作为因变量,经过单因素筛查后,将P<0.05的因素纳入多因素分析,校正了混杂因素影响后,多因素二分类logistic回归分析显示:年龄(OR:1.077,95%C1:1.029～1.126,P=0.001)、糖尿病肾病(OR:127.639,95%CI:27.603～590.128,P<0.001)、FGF23(OR:2.045,95%CI:1.988～7.999,P=0.015)、血磷(OR:3.615,95%CI:1.227～10.649,P=0.020)是 AAC 发生的独立危险因素,血清 sklotho(OR:0.856,95%CI:0.761～0.962,P=0.009)是AAC发生的保护因素。将CVC的发生与否作为因变量,经过单因素筛查后,将P<0.05的因素纳入多因素分析,校正了混杂因素影响后,血清sKlotho(OR:1.003,95%CI:0.998～1.008,P=0.282)对CVC发生的影响没有统计学意义。年龄(OR:1.123,95%CI:1.081～1.666,P<0.001)、糖尿病肾病(OR:9.580,95%CI:3.979～23.063,P<0.001)、CRP(OR:1.032,95%CI:1.001～1.085,P=0.021)是CVC发生的独立危险因素。5.基线水平有序多分类logistic回归分析AAC及CVC严重程度的影响因素将AAC及CVC严重程度(轻度、中度、重度)作为因变量,经过单因素筛查后,将P<0.05的因素纳入多因素分析,校正了混杂因素影响后,多因素有序多分类logistic分析显示只有糖尿病肾病是影响AAC严重程度的独立危险因素,非糖尿病肾病患者出现中、重度AAC的可能性是糖尿病肾病患者的17.5%(OR:0.175,95%CI:0.005～0.806,P=0.033)。糖尿病肾病也同时是 CVC 严重程度的独立危险因素,非糖尿病肾病患者出现中、重度CVC钙化的可能性是糖尿病肾病患者的 18.5%(OR:0.185,95%CI:0.013～0.241,P=0.002)。6.ROC曲线分析血清sklotho对AAC的诊断价值ROC 曲线下面积(area under the curve,AUC)显示血清 sklotho 诊断 AAC的 AUC 为 0.712(95%CI:0.638～0.787,P<0.001),截点值为 588pg/ml(约登指数最大的为0.331,对应的临界值为588pg/ml),敏感度为83.33%,特异度为59.42%。7.按血清sklotho四分位数分组及其随访结果7.1按照sklotho四分位数分组结果 Ⅰ组(sklotho<416pg/ml)62例;Ⅱ组:(416pg/ml ≤sklotho<568pg/ml)61 例;Ⅲ 组(568pg/ml ≤sklotho<746 pg/ml)65例;Ⅳ组(sklotho≥746 pg/ml)63例。最后随访结束时间为2019年1月。共有15(5.97%)例入选者因需要肾脏替代治疗(10例血液透析,5例腹膜透析)终止随访,16(6.37%)例患者发生非致死性急性心血管事件,并继续随访至24月。本研究随访期间出现6例失访病例,未发生全因死亡病例。随访结束后1周内完成第二次腹部平片检查并评分,有32(12.75%)例(其中新发钙化9例,原有钙化评分加重23例)入选者在随访结束后AAC评分增加。Ⅰ、Ⅱ、ⅢI、Ⅳ组发生急性非致死性心血管事件的例数分别为9(14.52%)例、4(6.56%)例、2(3.08%)例、1(1.59%)例,Fisher确切概率法检验结果显示,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。各组出现开始肾脏替代治疗例数分别为 Ⅰ组 14(22.58%)例、Ⅱ组 1(1.64%)例、Ⅲ组0(0%)例、Ⅳ组0(0%)例。Ⅰ组显著高于Ⅱ组,差异具有统计学意义(P<0.05)。AAC评分增加例数分别为Ⅰ 组20(32.26%)例、Ⅱ组7(11.48%)例、Ⅲ组4(6.15%)例、Ⅳ组 1(1.59%)例,差异具有统计学意义(P<0.001)。组间比较,经过Bonferroni校正后,Ⅰ组发生AAC评分增加例数显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05)。7.2随访2年结束对AAC评分增加的二分类logistic回归分析随访结束,剔除失访6例、开始肾脏替代治疗15例后,剩余230例入选者再次腹部X线检查行AAC评分。按AAC评分有无增加分为2组:AAC评分无增加组(n=198)和AAC评分增加组(n=32)。经过基线水平单因素筛查后,将P<0.05的因素纳入多因素二分类logistic回归分析,校正了混杂因素影响后,sklotho(OR:0.892,95%CI:0.886～0.999,P=0.023)是预测 CKD 非透析患者 2 年内AAC评分增加的独立影响因素(P<0.05)。7.3基线血清sklotho水平对预测2年内AAC评分是否增加的ROC曲线ROC曲线下面积(AUC)显示血清sklotho诊断AAC评分增加的AUC为0.778(95%CI:0.697～0.859,P<0.001),截点值为471.5pg/ml(约登指数最大的为0.534,对应的临界值为471.5pg/ml),敏感度为81.25%,特异度为72.15%。7.4不良事件的Kaplan-Meier生存分析以随访期间发生的急性非致死性心血管事件、开始肾脏替代治疗作为复合不良事件,Kaplan-Meier法分析显示无不良事件的平均生存时间Ⅰ组(sklotho<416pg/ml)为 21.25±0.63 月,低于 Ⅱ组 23.73±0.14 月、Ⅲ组 24 月、Ⅳ组 23.93±0.09月,差异具有统计学意义(Log-rank检验x2=41.716,P<0.001)。7.5 Cox比例风险回归模型分析发生不良事件的危险因素将单因素筛查的P<0.05的因素纳入多因素分析,校正混杂因素影响后,多因素Cox比例风险回归分析显示:年龄(HR:1.024,95%CI:1.002～1.046,P=0.032)、血清sklotho(HR:0.993,95%CI:0.987～0.999,P=0.023)是CKD非透析患者发生急性非致死性心血管事件、开始肾脏替代治疗的影响因素。结论1.CKD非透析患者早期即存在VC,CKD-5期VC发生率及其严重程度显著高于CKD1-3期;血清sklotho与eGFR成正相关关系,与AAC及CVC的发生和严重程度呈负相关关系。2.血清sklotho是CKD非透析患者发生AAC的保护因素,对AAC的发生有一定预测诊断价值,也是2年内AAC进展加重的独立预测因素;但对AAC的严重程度无影响;对CVC的发生及严重程度均无影响。3.低水平血清sklotho具有较高发生不良事件的风险,血清sklotho是CKD非透析患者发生急性非致死性心血管事件、开始肾脏替代治疗的预测因子,维持较高水平血清sklotho可能改善CKD非诱析患者的不良预后。