研究背景原发性胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)作为成年人最常见的颅内原发性恶性肿瘤已经得到广泛的关注。其早期症状非常隐匿,随着肿瘤细胞的增殖和侵袭,逐渐出现典型临床症状,包括语言、运动、感觉等神经功能损伤及颅内压增高的症状,显著降低患者的生活质量且明显缩短了患者的预期寿命。日前GBM患者即使接受国际上通行的标准治疗(即手术切除+术后放、化疗),他们的中位生存时间也只有14.6个月,5年的生存率<10%,且GBM术后残留的肿瘤组织会迅速增殖,并且可能对放化疗产生抵抗,这样不仅对患者家庭也给全社会带来了沉重的负担。随着现代科技的不断发展,各类新兴学科如雨后春笋,层出不穷。系统生物学(Systematic Biology)和生物信息学(Bioinformatics)作为生物学、计算机科学、数学等学科的交叉学科,得到了长足的发展,这就为阐明肿瘤这一类复杂疾病的发生、发展机制提供了强大的技术支持。加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)通过将肿瘤细胞内功能异常的分子网络划分成为不同的基因模块(共表达基因的集合),从而发现肿瘤发生进展中重要的驱动基因,成为肿瘤研究的一把利器。既往的众多研究已经证实,作为细胞内合成并保证蛋白质得到正确折叠的细胞器,内质网在肿瘤发生和进展中发挥了举足轻重的作用。内质网的功能在各种内源性或外源性不良因素的作用下都会受到影响,进而造成新生蛋白质合成和折叠过程的异常,这种现象被称为未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)。既往的研究证实UPR在 GBM细胞对替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)的治疗抵抗中起到了重要作用,因此通过干预UPR以降低GBM细胞对TMZ抵抗成为一种提高GBM疗效的重要策略。本课题利用WGCNA将GBM患者的表达谱数据进行模块化,并选定与GBM患者临床生存时间显著负相关的绿色模块以及其核心基因RUVBL1,并进行后续研究。根据目前的研究,RUVBL1对于细胞增殖非常重要,并已被证明在多种恶性肿瘤中发挥着促进肿瘤进展的作用。另外,RUVBL1的抑制剂最近已经被开发用于癌症治疗,这进一步表明人们对RUVBL1可作为抗肿瘤治疗靶点的期待。基于这些研究成果,本课题利用多种生物信息学分析工具对RUVBL1可能发挥的生物学功能进行预测,并设计了一系列分子生物学实验验证在GBM发生和进展中RUVBL1发挥的作用及其内在机制,为抗GBM治疗提供新的靶点。抗GBM药物作为标准疗法的重要组成部分,在目前临床使用普遍面对着疗效差且匮乏的尴尬境地,再加上化学合成药物本身毒副作用较大的缺点,因此,从天然药物中发掘新的、更加有效的抗肿瘤活性成份早已成为当前新药研发的重要思路。高良姜素(Galangin,GG)的抗肿瘤效应早已在白血病、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、头颈癌、子宫颈癌、视网膜母细胞瘤和乳腺癌等多种肿瘤中得到验证。与传统的化学药物相比,GG作为一种天然药物提取物,它的抗肿瘤效应具有低毒性和广谱性的特点。GG的化学结构为:3,5,7-三羟基黄酮,在蜂胶和姜科植物高良姜(Alpinia officinarum Hance)的干燥根茎中含量较高。GG具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗病毒、抗过敏等众多生物学效应。GG的抗肿瘤机制则包括逆转有氧糖酵解代谢、细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡、诱导内质网应激反应、诱导自噬、抑制肿瘤血管生长和细胞迁移。本研究第三部分则重点关注GG的抗GBM效应及机制。第一部分 应用加权相关网络分析筛选与胶质母细胞瘤患者预后相关的模块及核心基因研究目的通过对GBM样本表达谱数据进行WCGNA分析,筛选出与GBM患者临床特征密切相关的基因模块及其核心基因。方法通过WGCNA对中国神经胶质瘤基因组图谱(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)数据集mRNAseq325(batch2)进行分析,获得基因模块。随后,使用TCGA数据库、Rembrandt数据库数据库中的胶质瘤数据集进行验证,并借助蛋白蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)、基因本体论(gene ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析、人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas,HPA)数据库和GSEA(genesetenrichmentanalysis)分析等进一步挖掘目标基因的潜在功能及机制。结果1.通过绘制系统树图,去掉3个离群样本,对mRNAseq325(batch2)数据集剩余的323个样本表达谱进行分析,最后聚类形成14个基因模块。其中,绿色模块与无进展生存期(progression-free survival,PFS)和总生存期(overall survival,OS)呈显著负相关。2.绿色模块内共包括289个基因。对这些基因进行KEGG通路富集分析,结果显示这些基因主要富集到P53信号通路、小细胞肺癌、细胞周期、Wnt信号通路、肿瘤的转录调控的条目上。G0分析则显示这些基因富集到信号转导、G蛋白偶联的受体信号转导、正向调控细胞增殖、负向调控细胞凋亡、DNA修复和有丝分裂。作为核心基因,RUVBL1被选定在TCGA和Rembrandt数据库中进行验证。RUVBL1的mRNA表达量在胶质瘤样本中显著高于非肿瘤脑组织样本,且随着样本病理级别的增加而显著增高。RUVBL1的mRNA表达量越高,患者的预后越差。蛋白水平也体现相似特征,GBM>低级别胶质瘤组织>非肿瘤脑组织。将GBM样本根据RUVBL1分为高低表达组后进行GSEA分析,结果显示RUVBL1的高表达与蛋白酶体和泛素介导的蛋白水解功能两个分子标签正相关。结论绿色模块与样本的无进展生存期(Progression-free Survival,PFS)和总生存期(Overall Survival,OS)显著负相关。RUVBL1在胶质瘤样本中的mRNA表达水平与胶质瘤的病理级别呈现出显著正相关,同时RUVBL1高表达的胶质瘤患者预后普遍较差。第二部分 敲减RUVBL1抑制胶质母细胞瘤增殖并改善替莫唑胺耐药的机制研究研究目的探究敲减RUVBL1后对胶质母细胞瘤细胞增殖能力以及替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)抵抗的影响和机制。方法1.应用CCK-8细胞活力检测实验、细胞克隆形成实验、流式细胞周期实验、Western blot实验检测使用siRNA敲减RUVBL1后GBM细胞增殖能力的变化。2.利用慢病毒感染技术构建RUVBL1稳定敲减的U87MG-shRUVBL1 GBM细胞株,随后利用裸鼠颅内原位种瘤模型和生物发光成像技术、HE染色和免疫组化染色技术检测敲减RUVBL1后对GBM细胞在实验动物体内生长的影响。3.TMZ处理GBM细胞后利用CCK-8细胞活力检测实验、细胞克隆形成实验、透射电镜(TEM)观察、实时荧光定量PCR(Real-time qPCR,RT-qPCR)实验和Western blot实验等检测细胞活力、细胞内部结构以及相应基因、蛋白质的变化。4.利用TMZ梯度诱导法建立TMZ抵抗细胞株U87MG-R和LN229-R,并使用Western blot、RT-qPCR和细胞克隆实验验证TMZ抵抗。5.在U87MG-R和LN229-R细胞株中使用siRNA敲减RUVBL1,并应用EdU细胞增殖检测实验和流式细胞凋亡实验检测GBM细胞增殖能力和细胞凋亡的变化。6.应用慢病毒感染技术构建RUVBL1稳定敲除的TMZ抵抗细胞株U87MG-R-sh-RUVBL1 和 LN229-R-sh-RUVBL1,并利用 TEM、蛋白聚集体检测实验检测敲减RUVBL1后GBM细胞对TMZ抵抗情况的变化。使用siRNA在U87MG-R 和 LN229-R 细胞株中敲减 RUVBL1,并利用 RT-qPCR 和 Western blot检测在GBM细胞中敲减RUVBL1后蛋白酶体相关基因和内质网应激相关蛋白质的变化情况。7.使用RUVBL1的抑制剂Rottlerin单独或与TMZ联合处理GBM细胞,并应用CCK-8细胞活力检测实验、Caspase 3/7活性细胞凋亡检测实验、Western blot和裸鼠颅内原位种瘤模型检测Rottlerin抗GBM的效应。结果1.在U87MG和LN229两种细胞系中RUVBL1敲减组的72h的CCK8 OD450值显著低于对照组(p<0.05)。RUVBL1敲减组形成的细胞克隆数目较对照组降低了 50%-65%。另外,流式细胞周期实验显示RUVBL1敲减组中处于G0、G1期的细胞比例增加。Western blot结果也显示细胞周期相关蛋白CDK2和CCND1表达的下降,而细胞周期素抑制蛋白 P21的表达量显著增加。2.生物发光成像检测结果显示U87MG-sh-RUVBL1组的信号值明显低于U87MG-sh-Control组,且U87MG-sh-RUVBL1组中裸鼠的生存天数得到显著地延长(P<0.05)。U87MG-sh-RUVBL1组中肿瘤组织切片的HE染色和免疫组化染色结果显示,与对照组相比,实验组肿瘤体积明显较小,增殖相关的蛋白Ki67表达显著降低。3.根据CCK-8细胞活力检测实验计算IC50在U87MG细胞系中的IC50(CCK8 法)在 24h、48h 和 72h 分别为:1.154、1.249 和 1.346mM,在 LN229细胞中IC50则分别为:1.078、0.937和1.102mM。透射电镜(TEM)结果显示,当使用TMZ处理48小时后,同对照组相比,U87MG、LN229细胞中的粗面内质网发生肿胀伴扩张,吞噬溶酶体数目也显著地增加。RT-qPCR检测发现蛋白酶体基因PSMB7、PSMC4、PSMD12显著升高,而PSMA7则变化不明显。Western blot结果显示,U87MG、LN229在接受TMZ处理后,内质网应激相关信号通路蛋白:磷酸化肌醇需求酶1 α(p-IRE1 α)、磷酸化RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(p-PERK)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的蛋白表达水平显著地上调。4.Westernblot结果显示,与普通U87MG、LN229相比,TMZ抵抗细胞株U87MG-R和LN229-R中GRP78和RUVBL1的表达水平显著增加。RT-qPCR检测发现 GRP78、PSMB7、PSMC4、PSMD12 在 U87MG-R、LN229-R 细胞株中显著升高。细胞克隆实验显示接受TMZ(150 μM)处理后U87MG-R、LN229-R细胞形成的克隆数量比U87MG、LN229明显增多。5.EdU实验和细胞克隆形成实验研究GBM细胞增殖能力,结果显示敲减RUVBL1可以显著地降低U87MG-R和LN229-R的增殖能力。在同样剂量的TMZ 处理条件下,同 U87MG-R-sh-Control、LN229-R-sh-Control 细胞相比,U87MG-R-sh-RUVBL1和LN229-R-sh0-RUVBL1组形成的细胞克隆显著减少。流式细胞术显示在在同样剂量的TMZ处理条件下,si-RUVBLl-1和si-RUVBL1-2 组的早期凋亡阶段(AnnexinV+/PI-)和晚期凋亡阶段(AnnexinV+/PI+)的细胞比例明显增加。6.TEM 结果显示当使用 TMZ 处理 48h 后,U87MG-R-sh-Control、LN229-R-sh-Control细胞的粗面内质网和线粒体形态比较正常,而U87MG-R-sh-RUVBL1和LN229-R-sh-RUVBL1粗面内质网和线粒体明显肿胀、扩张。蛋白聚集体的染色显示U87MG-R-sh-RUVBL1和LN229-R-sh-RUVBL1细胞中的蛋白聚集体显著地增加。Western blot实验发现敲减RUVBL1后,GRP78、CHOP、p-PERK)、p-IRE1 α和Cleved Caspase3的表达水平显著升高。另外,RT-qPCR结果则显示接受与sh-NC-U87MG-R、sh-NC-LN229-R细胞相比,同样剂量的TMZ 处理后 sh-RUVBL1-U87MG-R 和 sh-RUVBL1-LN229-R 的蛋白酶体基因PSMB7、PSMC4、PSMD12基因上升趋势基本消失。7.CCK8法检测Rottlerin在U87MG细胞系中的IC50在24h和48h分别为:10.3 μM 和 7.8 μM,在 LN229 细胞中 IC50 则分别为:52.7 μ M 和 11.4 μM。另外,流式细胞凋亡实验和Caspase3/7活性检测实验结果也显示,与对照组和单纯TMZ使用组相比,Rottlerin和TMZ的联合应用使处于早期凋亡(AnnexinV+/PI-)和晚期凋亡(AnnexinV+/PI+)阶段的GBM细胞比例和剪切的Caspase3/7活性显著地增加。生物发光成像检测结果显示Rottlerin和TMZ联合使用组的信号值明显低于对照组和TMZ组相比,且联合使用组中裸鼠的生存天数得到显著延长(与各组相比,分别为P<0.001,P<0.01,P<0.05)。结论1.动物体内外实验证实敲减RUVBL1可显著抑制GBM细胞的增殖。2.内质网应激在GBM细胞对TMZ产生抵抗过程中起到了重要作用,敲减RUVBL1可加剧GBM细胞中的内质网应激和未折叠蛋白反应,进而诱发细胞凋亡。3.联合使用Rottlerin与TMZ可加剧GBM细胞的内质网应激和未折叠蛋白反应杀伤肿瘤细胞,从而改善TMZ抵抗,提高TMZ的抗肿瘤效果。第三部分天然类黄酮高良姜素抗胶质母细胞瘤的效应及机制研究研究目的通过生物信息学和文献挖掘,筛选出可能具有抗GBM效应的天然类黄酮高良姜素(Galangin,GG),并探究其抗GBM效应及机制。方法1.应用CCK8细胞活力检测实验、细胞克隆形成实验、EdU细胞增殖检测实验、流式细胞周期实验和Western blot实验检测使用GG处理后GBM细胞增殖能力的变化。2.利用Cleaved Caspase3/7荧光染色实验、流式细胞凋亡实验和Western blot实验检测GG是否可诱导GBM细胞发生凋亡。3.利用暗视野显微镜、生物信息学分析和Western blot实验检测GG是否可诱导GBM细胞发生焦亡。4.利用RNAi技术、CCK8细胞活力检测实验、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)释放实验、磷酸化H2A.X(Ser139)的免疫荧光染色和Western blot实验验证GG诱导的焦亡和凋亡之间的关系。5.利用稳定转染的 RFP-GFP-MAP1LC3B-U87MG 细胞株、TEM 和 Western blot实验检测使用GG处理GBM细胞是否可诱导细胞自噬的发生,并利用自噬抑制剂、AMPK通路特异性阻滞剂验证自噬的发生、信号传导通路及自噬及凋亡、焦亡之间的关系。6.采用慢病毒感染技术构建带有荧光素酶的U87MG细胞株并种入裸鼠颅内形成异种移植瘤模型,并分别给与二甲基亚砜(DMSO)、GG、自噬抑制剂氯喹(CQ)以及GG和CQ,通过小动物成像、Westernblot实验和免疫组织化学验证GG在体内的抗肿瘤效应。结果1.CCK8、细胞克隆形成实验的结果显示,GG对U87MG、U251和A172三种GBM细胞的活力具有显著的抑制效应,且抑制效应呈现浓度依赖性。EdU实验和流式细胞周期实验结果显示GG处理后处于增殖期的细胞与对照组相比显著地降低。Western blot实验结果也显示出类似的蛋白水平变化。2.Cleved Caspase3/7荧光染色实验、流式细胞凋亡实验显示GG处理后发生凋亡的细胞比例显著地增加。Western blot实验结果也显示GG可以诱导GBM细胞发生凋亡。3.根据暗视野显微镜下所见,我们认为GG可诱导GBM发生细胞焦亡,借助TCGA和Rembrandt数据库,发现GBM样本中GSDME的mRNA表达量较非肿瘤组织显著升高。进一步利用Western blot实验结果显示GBM细胞在接受GG处理后GSDME的N端蛋白表达量增加也进一步证实GG可诱导GBM细胞发生由GSDME介导的细胞焦亡。4.敲减GSDME并不影响GBM细胞的活力。LDH释放试验结果显示GSDME敲减组U87MG和U251细胞的LDH释放量显著地下降。磷酸化H2A.X(Ser139)荧光染色实验和Western blot实验结果显示出敲减GSDME会加重GG处理后细胞核损伤。5.我们利用稳转的RFP-GFP-MAP1LC3B-U87MG细胞自噬流荧光检测实验、TEM和Western blot实验发现GG可诱导GBM细胞发生自噬,且依赖于AMPK-mTOR通路。为了探究GG诱导的细胞自噬与凋亡、焦亡三者之间的关系,我们选择3-MA阻断自噬流,Western blot实验结果显示阻断自噬后GG诱导的细胞凋亡标记Cleaved PARP-1和BAX以及细胞焦亡标记GSDME的N端蛋白表达量显著地增加。6.我们利用异种移植模型分别给与相应处理,小动物成像结果发现GG处理组较对照组显著降低,而GG+CQ联合处理组的信号则是四组中最低的。我们记录各实验组小鼠的体重,发现在第2周和3周GG+CQ联合处理组中小鼠的平均体重显著地高于GG处理组以及对照组中的小鼠的平均体重。动物实验结束后,留存各组肿瘤样本并提取蛋白后行Western blot实验,结果显示与对照组和GG处理组相比,GG+CQ联合处理组样本中的MAP1LC3B-Ⅱ表达水平显著地增高。组织切片免疫组化也显示GG+CQ联合处理组样本中细胞增殖标记Ki67阳性细胞比例最低。结论GG通过诱导细胞凋亡、焦亡和自噬发挥抗GBM效果,抑制自噬后加重GBM细胞凋亡、焦亡,并且可增强体内抗肿瘤效应。GG可诱导的由GSDME介导的细胞焦亡,敲减GSDME会加重GG引起的GBM细胞核损伤。