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第一部分microRNA-224在DLBCL细胞株中的表达及对细胞株增殖、侵袭、凋亡的影响目的：microRNA-224 (miR-224)在细胞中参与调控多种生物学信号传导通路,通过调节靶基因的表达来影响肿瘤的发生、发展。在弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中,其作用机制仍不清楚。本实验旨在研究活化细胞型、生发中心型DLBCL细胞株以及正常B淋巴细胞中miR-224的表达水平；以及干扰miR-224在DLBCL细胞株中的表达后对细胞株的增殖、侵袭能力和凋亡的影响。方法：采用胶原酶和胰蛋白酶原消化碎化的扁桃体,并使用流式细胞仪分选、提取表达CD19+B淋巴细胞；采用qRT-PCR检测比较弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株OCI-LY3、OCI-LY10(ABC-type)和OCI-LY18、OCI-LY19(GCB-type)以及正常CD19+B淋巴细胞的miR-224的表达水平;使用mimic-miR-224转染OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19后,采用qRT-PCR检测转染后OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19的miR-224的表达水平的变化；并采用MTT法检测转染后OCI-LY3、OCI-L1Y10和OCI-LY18、OCI-LY19细胞增殖水平的变化；使用Transwell法检测转染后对OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19细胞的体外侵袭能力的影响；采用流式细胞术检测转染后对OCI-LY3、 OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19细胞的凋亡的影响。结果：使用Ficoll离心获取单个核细胞层后,采用流式细胞术分选可获得纯度90%以上表达CD19+B淋巴细胞；qRT-PCR检测结果表明DLBCL细胞株中miR-224的表达明显低于正常B淋巴细胞(P<0.05),且ABC-型与GCB-型DLBCL细胞株的miR-224表达水平无显著差异；qRT-PCR检测结果显示mimic-miR-224转染后ABC-型与GCB-型DLBCL细胞株的miR-224表达水平显著增加(P<0.01)；MTT结果显示,在转染24h、48 h、72 h和96 h后,OCI-LY3/mimic-miR-224细胞在48h、72h和96h的增殖能力较OCI-LY3/mimic-control分别下降至86%(P<0.05),82%(P<0.05),74%(P<0.01); OCI-LY10/ mimic-miR-224细胞在48h、72h和96h的增殖能力较OCI-LY10/mimic-control分别下降至79%(P<0.01),75%(P<0.01),68%(P<0.01); OCI-LY 18/mimic-miR-224细胞在48h、72h和96h的增殖能力较OCI-LY18/mimic-control分别下降至83%(P<0.01),78%(P<0.01),71%(P<0.01);OCI-LY19/mimic-miR-224细胞在48h、72h和96h的增殖能力较OCI-LY19/mimic-control分别下降至85%(P<0.01),78%(P<0.01),69%(P<0.01);细胞体外侵袭力测定结果显示：OCI-LY3/mimic-miR-224、OCI-LY10/mimic-miR-224、OCI-LY18/mimic-miR-224及OCI-LY19/mimic-miR-224组中穿膜细胞的数量分别是OCI-LY3/mimic-control、 OCI-LY10 mimic-control、OCI-LY18/mimic-control及OCI-LY19/mimic-control组的71%(P<0.05)、60%(P<0.01)、82%(P<0.05)及81%(P<0.05)；流式细胞术检测结果显示：OCI-LY3/mimic-miR-224、OCI-LY10/mimic-miR-224、OCI-LY18/mimic-miR-224及OCI-LY19/mimic-miR-224组细胞的凋亡率显著高于OC1-LY3/mimic-control、OCI-LY10/mimic-control、OCI-LY18/mimic-control及OCI-LY19/mimic-control组(P<0.05)。结论：弥漫大B细胞淋巴瘤细胞miR-224表达水平明显低于CD19+B淋巴细胞的miR-224表达水平,且ABC-型与GCB-型DLBCL细胞株的miR-224表达水平无显著差异；使用RNA干扰技术特异性增加OCI-LY3、OCI-LY10、OCI-LY18和OCI-LY19细胞miR-224表达后,细胞增殖、侵袭能力受到明显抑制,凋亡增加,说明miR-224表达水平的变化能影响OCI-LY3、OCI-LY10、OCI-LY18和OCI-LY19细胞生物学行为的改变；推测miR-224表达失调在弥漫大B细胞淋巴瘤的发生、发展中起始动、触发作用。第二部分miR-224在DLBCL细胞株中靶基因预测、筛选及验证目的：准确预测miR-224在弥漫大B细胞淋巴瘤中的靶基因对于研究miR-224在弥漫大B细胞淋巴瘤中的功能以及分析miR-224所参与的生物学过程有重要的意义。本实验使用生物信息学方法预测并筛选miR-224靶基因,采用分子生物学方法验证miR-224靶基因从而为发病机制、治疗以及预后评判提供新的策略和思路。方法：使用nicroRNA靶基因预测软件TargetScan 5.1、miRDB、miRWalk、 RNA22及miRanda预测miR-224的靶基因：依据预测软件积分及结合弥漫大B细胞淋巴瘤的免疫化学治疗特征筛选miR-224的靶基因；采用荧光素酶报告基因实验直接验证miR-224的靶基因：使用qRT-PCR、流式细胞仪、Western Blot方法检测mimic-miR-224转染OCI-LY3、OCI-LY10和OCI-LY18、OCI-LY19后靶基因mRNA及靶基因蛋白表达的变化。结果：TargetScan 5.1、miRDB、miRWalk、RNA22及miRanda均准确预测CD59为miR-224的靶基因；荧光素酶报告基因方法实验证明了CD59是miR-224的靶基因；流式细胞术、Western blot及qRT-PCR法检测发现mimic-miR-224转染后细胞中miR-224的表达量显著增加,CD59的蛋白表达明显降低(P<0.05),CD59的mRNA的量变化无统计学意义(P>0.05)。结论：CD59为miR-224的靶基因；miR-224在转录后水平对CD59表达进行调节。第三部分microRNA-224在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义目的：miR-224在DLBCL细胞株中低表达已得到证实,其表达水平的变化对DLBCL细胞生物学行为产生影响,miR-224表达失调或为DLBCL的发生、发展中起始动、触发作用：本实验拟分析miR-224在DLBCL患者中的表达及其与临床病理特征以及预后之间的关系。方法：选取168例DLBCL患者为研究对象,采用qRT-PCR技术检测其miR-224的相对表达量,并探讨miR-224表达水平与临床病理特征及预后的关系。结果：168例DLBCL患者淋巴组织中miR-224表达水平均值为0.97±0.33,正常淋巴结组织表达水平均值为1.87±0.43,两者差异有统计学意义(P<0.05)；miR-224在DLBCL患者中的表达与患者年龄(P=0.4342)、性别(P=0.6129)、疾病分期(P=0.2498)、国际预后指数(P=0.3547)、LDH(P=0.3985)均无明显相关性；miR-224在GCB患者组与ABC患者组表达水平无显著差异(P>0.05)；miR-224表达水平在CR组最高,PR组次之,SD+PD组最低,差异均有统计学意义(P<0.05)；以DLBCL患者miR-224表达水平的平均值为阈值,将患者分为高表达组和低表达组,两组患者的5年无进展生存率及总生存率差异均有统计学意义(P值均<0.05),前者均较后者高。结论：miR-224可能作为抑癌基因参与了DLBCL的发生、发展,其表达水平可作为DLBCL患者预后判断的标志物,有助于指导临床个体化及分层治疗,从而改善患者预后。第四部分CD59在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义目的：miR-224在DLBCL患者病理组织中表达水平较正常对照组为低,且证实miR-224表达水平与临床病理特征及预后的有关；本实验拟分析miR-224的靶基因CD59在DLBCL患者病理组织中的表达及其与临床病理特征以及预后之间的关系。方法：选取186例DLBCL患者为研究对象,采用组织微阵列及免疫组化方法检测其CD59的相对表达量,并探讨CD59表达水平与临床病理特征及预后的关系。结果：186例DLBCL患者中,有151例患者病理组织免疫组化提示CD59阳性,其中68例为GCB型DLBCL (36.6%),83例患者为ABC型DLBCL(44.6%)：在35例CD59阴性表达的DLBCL患者中,18例为GCB型DLBCL(9.7%),17例患者为ABC型DLBCL (9.1%); ABC型DLBCL患者与GCB型DLBCL患者淋巴组织中CD59表达水平两者差异无统计学意义(P>0.05)。CD59在DLBCL患者中的表达与患者年龄、性别、疾病分期、国际预后指数、LDH均无相关性。获得完全缓解的患者中的CD59表达水平显著低于未达完全缓解的患者,差异有统计学意义(P<0.05)。其中疾病进展及疾病稳定组CD59表达量最高,部分缓解组次之,完全缓解组CD59表达水平最低,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素统计学分析提示在DLBCL患者中表达CD59的肿瘤细胞超过50%以及存有B症状和高IPI分值是独立的预后不良因素。以CD59表达水平的平均值为阈值,将患者分为高表达组和低表达组,两组患者的2年无进展生存率及总生存率差异均有统计学意义,后者均较前者高。结论：CD59其表达水平可作为DLBCL患者预后判断的标志物,可在早期筛选预后不良的病例,有助于临床治疗方案的选择及改善预后。