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中药和化学药物各有其优点,在临床治疗中,为了标本兼治,增强疗效,中西药合用越来越普遍。近来有文献报道中药与西药合并使用后产生严重的不良反应,如贯叶连翘提取物(St John’s wort)与环孢素合用导致移植病人发生排斥反应,与口服避孕药合用导致病人的出血反应或避孕失败等,已成为临床治疗学上极为关注的问题。进一步的研究表明,其相互作用发生的机制是由于代谢性相互作用引起的,其中最主要由细胞色素P450酶介导的。国内心血管类中成药采购量遥遥领先于其它类中成药,其中祛瘀剂在心血管系统中占相当大比例。因此,本研究将采用"cocktail"探针底物法和LC-MS/MS测定方法,对18种祛瘀剂进行系统研究,确证所研究的祛瘀剂对5种CYP450酶(CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4)的抑制作用,然后根据试验结果给出这些祛瘀剂警示性的应用注意事项,给临床使用这些祛瘀剂提供参考性依据。第一部分同时测定五种CYP450酶的底物代谢产物的LC-MS/MS方法建立与验证目的：建立同时测定五种CYP450酶的探针底物的相应代谢产物：对乙酰氨基酚(CYP1A2)、4-羟基甲苯磺丁脲(CYP2C9)、5-羟基奥美拉唑(CYP2C19)、右啡烷(CYP2D6)、1’-羟基咪达唑仑(CYP3A4)的LC-MS/MS分析方法。方法：以含内标的乙腈溶液沉淀蛋白处理样品,色谱柱：CAPCELL PAK C18柱(MGⅢ,100 mm×2.0mmID,5μm);流动相A：水／甲酸(100：0.02,v／v),流动相B：乙腈／甲酸(100：0.02,v／v),流速0.3 mL/min,采用快速梯度洗脱程序0～4 min, B%(5%～70%), 4～4.1 min, B%(70%～5%),4.1～7 min, B%(5%);电喷雾离子源(ESI),三级四级杆串联质谱,多级反应监测进行定量,选择极性切换方式进行正负离子同时扫描(4.4 min正离子扫描,然后2.6 min负离子扫描),4-羟基甲苯磺丁脲做负离子扫描,其余做正离子扫描。结果：基质中对乙酰氨基酚在100-20000 nM、4-羟基甲苯磺丁脲3.5-700 nM、5-羟基奥美拉唑3-600 nM、右啡烷3-600 nM、1’-羟基咪达唑仑4-800 nM的浓度范围内线性关系良好。各测定物的批内和批间方法回收率分别为95.71～108.69%和95.19～106.77%,RSD分别为2.99～10.62%和2.84～10.90%,最低定量限介于3-100nM之间。结论：该方法快速、灵敏、准确,可以在体外用于同时预测化合物对五种CYP450酶活性的抑制作用。第二部分人肝微粒体制备及蛋白含量测定目的：制备肝微粒体并测定蛋白含量。方法：采用差速离心法,首先将肝组织剪碎后用1.15%KCl-50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)反复淋洗,擦干后称重,以1：3(w／v)比例加入缓冲液,制成匀浆,将制得的匀浆在4℃以10 000 g离心30 min后,取上清液在4℃以下10 5000 g离心60 min,所得沉淀即为肝微粒体,用适量的含20%丙三醇的磷酸缓冲液将肝微粒体溶解后放置-80℃冰箱保存,用Bradford法测定微粒体蛋白含量,采用"cocktail"底物孵育法及LC-MS/MS法测定CYP450五种酶的活性。结果：共制备两批肝微粒体,测得蛋白含量分别为67.2 mg/mL和33.4 mg/mL,孵化进样测定后,五种代谢产物均有生成且产量较高。结论：该制备肝微粒体的方法操作简便,所制备的微粒体是有活性的可在-80℃下长期保存,活性无明显下降。第三部分"Cocktail"探针底物法同时预测祛瘀剂对五种CYP450酶的抑制作用目的：验证体外孵化反应体系,采用"cocktail"探针底物法同时预测祛瘀剂预测浓度对五种CYP450酶活性的抑制作用及IC50值。方法：孵化反应体系中包括"cocktail"探针底物(探针底物最终浓度分别为：35／170／10／10／4μM,非那西丁／甲苯磺丁脲／奥美拉唑／右美沙芬／咪达唑仑,与Km值接近)、肝微粒体、NADPH及磷酸缓冲液,总体积为200μL,以第一部分建立的LC-MS/MS分析方法测定生成的代谢产物,选择CYP450酶特异性抑制剂：α-萘黄酮(CYP1A2)、硫酸奎尼丁(CYP2D6)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、氟康唑(CYP2C19)、酮康唑(CYP3A4)或祛瘀剂系列浓度加入"cocktail"探针底物的反应体系中,测定生成的代谢物,将代谢产物的峰面积与内标的峰面积之比与对照样品(抑制剂浓度为0的样品)中两者的面积比相比较,以前者占对照样品的百分比为纵坐标,抑制剂浓度的对数值为横坐标,计算相应IC50值。祛瘀剂预测浓度加入"cocktail"探针底物的反应体系中,测定生成的代谢物,数据以试验组占对照组的百分比表示,对照组与试验组做t-检验。结果：五种特异性的抑制剂与"cocktail"探针底物反应后所得的IC50值在文献报道值3倍以内。1)预测浓度：①主要成分为丹参或黄酮的祛瘀剂：丹参注射液(DZY)对五种CYP450酶的抑制作用强于阳性抑制剂(1μM)；心可舒片(XSP)显著抑制CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4;丹参片(DSP)、心达康片(XKP)和复方丹参片(FDP)显著抑制CYP1A2活性；②主要成分为皂苷的祛瘀剂：血栓通注射液(XZY)显著抑制CYP1A2和CYP3A4活性,增强CYP2C9的活性；地奥心血康(DXJ)增强CYP1A2和CYP2D6的活性；血塞通片(XTP)和心脑舒通胶囊(XSJ)分别增强CYP2C9和CYP3A4的活性；③含5味草药以上的祛瘀剂：血府逐瘀胶囊(XZJ)抑制CYP1A2、CYP2C19和CYP2D6的活性,增强CYP2C9的活性；脑心通胶囊(NXJ)抑制CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的活性；麝香保心丸(SBW)抑制CYP1A2,通心络胶囊(TXJ)增强CYP1A2活性；④银杏叶片(YXP)、速效救心丸(SJW)和阿魏酸钠片(SFT)对5种CYPs无显著影响。2)IC50值：①主要成分为丹参或黄酮的祛瘀剂：丹参注射液对5种CYP450抑制的IC50值均较小；心达康片对CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6,心可舒片对CYP1A2和CYP2D6及复方丹参片对CYP1A2的IC50值均小于100μg/mL;②主要成分为皂苷的祛瘀剂：血栓通注射液对CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4的IC50值均较小；血塞通软胶囊显著增强CYP3A4的活性,在浓度为1 mg/mL时,实验组活性是对照组的227.75%；③含5味草药以上的祛瘀剂对5种CYPs的IC50值均大于100μg/mL;④速效救心丸对CYP1A2、CYP2C19和CYP3A4的IC50值均小于100μg/mL;银杏叶片和阿魏酸钠片对5种CYPs的IC50值大于100μg/mL。结论：CYP1A2是最容易受影响的亚型；主要成分为丹参提取物或黄酮类化合物的祛瘀剂,如丹参注射液、心达康片、心可舒片显著抑制CYP450酶的活性,这些药物与经过CYP450酶代谢的药物联合应用时,可能会引起药物相互作用所致的不良反应,临床联合应用应提高警惕。