目的:非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）是全球范围内非常常见的一种慢性肝脏疾病,其发病机制以肝脏内脂质过量蓄积、肝细胞脂肪性变性、肝细胞脂质过氧化和氧化应激及肝内炎症细胞浸润为主要特征。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）为细胞增殖、分化和凋亡及蛋白合成等的重要调控因子,也参与NASH病理过程的发生发展。而P18/LAMTOR1的存在与否影响着mTORC1是否能定位于溶酶体膜表面从而被激活继而发挥生理病理作用。本研究重点探究特异性敲除肝脏P18/LAMTOR1基因后对NASH肝组织脂代谢、炎症状态及内质网应激信号通路相关关键信号因子的影响,深入探讨P18/LAMTOR1通过mTORC1影响NASH的作用机制。方法:1.P18/LAMTOR1肝脏特异性敲除小鼠的构建和检测:采用背景为C57BL/6的小鼠品系,利用打靶载体同源重组技术,在肝细胞基因组P18/LAMTOR1外显子两侧各插入一个loxp序列。借助于Cre-Loxp重组酶系统将特定基因敲除,因为Cre蛋白能识别loxp序列并切除两个loxp序列之间的基因片段。通过在Albumin-Cre（Alb-Cre）小鼠基因组插入一段同时连有albumin启动子和Cre基因的序列,使Cre蛋白在肝脏特异性表达。将这两种小鼠进行多次杂交,得到基因型为P18/LAMTOR1 flox/flox,Alb-Cre的子代小鼠,实现肝脏特异性敲除P18/LAMTOR1基因的目的,即为实验组小鼠(P18/LAMTOR1^LKO组)（liver knockout,LKO）。2.动物的饲养及动物处理:所有小鼠均被安置于SPF级屏障环境中饲养。本研究使用21天大小的小鼠进行起始杂交配种,每产一窝子代雄鼠待对其进行基因鉴定符合P18/LAMTOR1基因特异性敲除后便将其饲养至8-10周龄时处死,并且以同窝生的其他雄鼠作为实验对照组小鼠(P18/LAMTOR1^flox/flox组)。两组小鼠均采血,提取肝脏。3.测定指标及方法:3.1使用全自动生化分析仪测定两组小鼠的血清ALT和AST水平;3.2对两组小鼠的肝脏组织进行HE染色;3.3 Western Blotting实验检测两组小鼠肝脏组织mTOR、P-mTOR、P-S6K和P-JNK蛋白表达;3.4 RT-PCR检测两组小鼠肝脏组织炎症相关因子IL-1β和miNOS,内质网应激相关因子BIP、CHOP和ERDJ4,脂质合成相关因子SREBP1c、SCD1、FASN、ACC1和DGAT1,脂质分解相关因子PPARα、PPARγ、ACOX1、PGC1α和FGF21的mRNA表达水平。结果:1.两组小鼠血清ALT和AST变化:P18/LAMTOR1^LKO实验组小鼠血清ALT、AST水平（ALT:55.786±11.131 U/L,AST:83.740±14.729 U/L）较P18/LAMTOR1^flox/flox对照组血清ALT、AST水平（ALT:22.412±6.592 U/L,AST:30.898±14.831 U/L）明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;2.两组小鼠肝脏组织HE染色比较:光镜下可见P18/LAMTOR1^flox/flox对照组小鼠肝组织中肝窦清晰可见,肝索排列整齐,肝小叶边界规整。肝细胞大小正常,排列有序,细胞核圆形而居中,细胞质染色均匀,内无脂滴积聚,未见脂肪变性及炎症改变。P18/LAMTOR1^LKO实验组小鼠肝组织中肝窦变窄甚至消失,部分区域肝索排列紊乱,肝小叶边界模糊不清。肝细胞肿胀变大,彼此边界模糊。在细胞质中可观察到不同大小的脂滴呈点灶状分布,还可见炎性细胞浸润;3.两组小鼠肝脏炎症变化:RT-PCR检测结果显示,P18/LAMTOR1^LKO实验组小鼠肝组织中炎症相关因子IL-1β、miNOS mRNA表达水平（IL-1β:0.013±0.005,miNOS:0.002±0.006）较P18/LAMTOR1^flox/flox对照组（IL-1β:0.0007±0.0004,miNOS:0.0002±0.00009）明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;P-JNK蛋白明显表达;4.两组小鼠肝脏mTOR信号通路相关因子蛋白表达变化:P18/LAMTOR1基因肝脏特异性敲除后,抑制mTOR和S6K活化,P-mTOR蛋白表达稍降低,P-S6K蛋白表达明显减少,未影响mTOR总蛋白的表达;5.两组小鼠肝脏内质网应激相关因子mRNA表达变化:RT-PCR检测结果显示,P18/LAMTOR1^LKO实验组小鼠肝组织中内质网应激相关因子BIP、CHOP和ERDJ4mRNA表达水平（BIP:0.246±0.002,CHOP:0.003±0.0003,ERDJ4:0.046±0.005）较P18/LAMTOR1^flox/flox对照组（BIP:0.188±0.025,CHOP:0.002±0.0007,ERDJ4:0.035±0.003）明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;6.两组小鼠肝脏脂代谢相关因子mRNA表达变化:RT-PCR检测结果显示,与P18/LAMTOR1^flox/flox对照组相比较,P18/LAMTOR1^LKO实验组小鼠肝组织中脂代谢相关因子SREBP1c（实验组:0.002±0.0001 vs对照组:0.053±0.008）、SCD1明显降低,FASN、ACC1、DGAT1、PPARα（实验组:0.011±0.0002 vs对照组:0.004±0.002）、PPARγ、ACOX1、PGC1α和FGF21明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.P18/LAMTOR1基因肝脏特异性敲除能抑制mTORC1下游S6K的磷酸化,加重NASH小鼠的肝功和炎症恶化程度;2.P18/LAMTOR1基因肝脏特异性敲除能增强NASH小鼠的内质网应激;3.P18/LAMTOR1基因肝脏特异性敲除能明显影响NASH小鼠的脂代谢情况,包括脂质合成和脂质分解。