RAGE参与CRP诱导的循环内皮细胞释放

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研究背景:   川崎病是一种在5岁以下儿童中常见的急性发热性疾病,以全身性中小动脉炎症损伤为主要特征,尤其以冠状动脉损伤最为严重和常见。川崎病的病因不明,以全身性中小动脉炎症损伤为主要病理特征,尤其以冠状动脉损伤最为严重和常见。晚期糖基化终末产物受体(Receptor for Advanced Glycation End ProductsRAGE)是免疫蛋白超家族中的一员。S100A12是一种促炎因子,可以与RAGE结合,S100A12-RAGE轴在各种疾病中的促炎作用被许多研究所证实。血管内皮细胞是一层连续覆盖于整个血管腔表面的扁平细胞,在炎症反应中起着重要作用,内皮细胞功能紊乱不仅仅是心血管损伤的早期表现,而且在整个内皮损伤过程中起着重要作用。循环内皮细胞是内皮损伤的标志物,血液中循环内皮细胞增加往往意味着更高的心血管损伤风险。我们先前的研究发现川崎病患儿循环内皮细胞增加,循环内皮细胞上S100A12及其受体RAGE表达增加,而且这种增加在有冠状动脉损伤的患儿中更为明显,但S100A12与RAGE在川崎病心血管病变中的的作用与机制有待于进一步明确。CRP是一种急性期蛋白,在多种炎症疾病中会反应性增高,许多研究证实CRP不仅是一种炎症因子,而且直接参与了内皮损伤的过程,川崎病急性期有普遍的CRP水平升高,而且有较高水平CRP的患儿罹患冠状动脉损伤的风险更高。有研究证实CRP与RAGE有密切联系,CRP能诱导内皮RAGE的表达升高,而且RAGE可能参与了CRP诱导的细胞损伤,但CRP与RAGE之间的关系仍然有待进一步研究证实。   目的:   用不同浓度的重组人S100A12蛋白或人血浆来源的CRP作用于培养的人冠状动脉内皮细胞,观察不同浓度组循环内皮细胞数量的变化,比较S100A12或CRP作用对循环内皮细胞数量的影响。建立小干扰RNA(siRNA)干扰RAGE表达,观察RAGE沉默是否能抑制CRP诱导的循环内皮细胞变化。   方法:   人冠状动脉内皮细胞购自ATCC(美国模式菌种收集中心),4-6代细胞用于所有实验。   第一部分:CRP或S100A12对循环内皮细胞数量的影响   分别用不同浓度的CRP(0,12.5,25,50μg/ml)或者S100A12(0,4,10,25μg/ml)与人冠状动脉内皮细胞共同孵育24h,收集细胞,测定不同浓度CRP或S100A12作用内皮细胞24h后,各浓度组循环内皮细胞的数量。循环内皮细胞数量测定采用流式细胞术,用anti-CD146-FITC,anti-CD105-APE,anti-CD45-Percp-cy5.5,anti-CD34-PE染色细胞,筛选CD146(+),CD105(+),CD45(-),CD34(+)为循环内皮细胞,每组实验重复4次。   第二部分:RAGE小干扰RNA(siRNA)的建立   设计合成3条siRNA用于沉默内皮细胞RAGE表达,另外设计了FITC标记的siRNA-GADPH作为阳性对照,用于检测siRNA转染效率,以及无效siRNA作为对照组,用于检测siRNA沉默RAGE效率。转染试剂为Lipofectamine2000Transfection Reagent,待细胞长至40%左右开始进行转染。   (1) siRNA转染人冠状动脉内皮细胞效率检测:   用FITC标记的内参siRNA-GADPH转染细胞6h后,除去培养基,用PBS液洗细胞3次后,Hoechst室温避光染色30min,再洗涤细胞3次,荧光显微镜观察红色荧光和蓝色荧光,计算转染成功细胞百分比。   (2) siRNA沉默人冠状动脉内皮细胞RAGE表达检测   分别用siRNA1、siRNA2、siRNA3转染细胞,并用无效siRNA作为对照组,48h后相对定量Real-time PCR检测细胞mRNA水平上RAGE表达,每组实验重复3次。   第三部分:RAGE干扰RNA抑制了CRP诱导的循环内皮细胞增加   25μg/ml浓度的CRP分别作用于人冠状动脉内皮细胞和RAGE沉默(siRNA作用24h)后的人冠状动脉内皮细胞,并设立空白及对照组,比较不同组循环内皮细胞数量的变化,每组实验重复4次。   结果:   第一部分:CRP诱导了循环内皮细胞的释放,但S100A12未能诱导循环内皮细胞释放   1.不同浓度S100A12与内皮细胞共孵育24h对循环内皮细胞释放的影响   与对照组相比,S100A12作用后,各浓度组循环内皮细胞数量差异较小。各S100A12(0,4,10,25μg/ml)浓度组循环内皮细胞百分比值分别为:11.97±4.16%,11.08±6.02%,10.91±3.16%,9.66±0.64%,各组差异无统计学意义。   2.不同浓度CRP与内皮细胞共孵育24h对循环内皮细胞释放的影响   与对照组相比,CRP作用后,循环内皮细胞数量均增加,存在一定浓度依赖关系,当CRP浓度>25μg/ml时,循环内皮细胞数量显著增加。各CRP(0,12.5,25,50μg/ml)浓度组循环内皮细胞百分比值分别为:6.82±1.64%,9.66±3.39%,12.22±3.33%,12.47±4.25%。与对照组相比25μg/ml及50μg/ml组差异有统计学意义。   第二部分:RAGE小干扰RNA(siRNA)的建立和检测   1.约>80%细胞成功转染siRNA   2.与对照组相比,siRNA1、siRNA2、siRNA3均能在mRNA水平上沉默RAGE表达,siRNA2沉默效率最高,波动最小,各siRNA干扰组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)与对照组比较,mRNA水平上RAGE表达百分比分别为:0.53±0.16,0.34±0.08,0.45±0.20。   第三部分:siRNA抑制了CRP诱导的循环内皮细胞释放   siRNA沉默RAGE抑制了CRP诱导的循环内皮细胞增加,各组循环内皮细胞百分比值分别为:空白组10.39±2.93%,对照组:9.28±6.40%,CRP组:13.22±2.64%,CRP+siRNA组:8.77±2.16%。CRP组与对照组差异有统计学意义,CRP+siRNA组与CRP组差异有统计学意义。   结论:   (1) CRP诱导了人冠状动脉内皮细胞来源的循环内皮细胞释放。   (2)成功建立了人冠状动脉内皮细胞RAGE基因小干扰RNA(siRNA)。   (3) RAGE参与了CRP诱导的循环内皮细胞释放。
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