研究背景:　　 川崎病是一种在5岁以下儿童中常见的急性发热性疾病，以全身性中小动脉炎症损伤为主要特征，尤其以冠状动脉损伤最为严重和常见。川崎病的病因不明，以全身性中小动脉炎症损伤为主要病理特征，尤其以冠状动脉损伤最为严重和常见。晚期糖基化终末产物受体(Receptor for Advanced Glycation End ProductsRAGE)是免疫蛋白超家族中的一员。S100A12是一种促炎因子，可以与RAGE结合，S100A12-RAGE轴在各种疾病中的促炎作用被许多研究所证实。血管内皮细胞是一层连续覆盖于整个血管腔表面的扁平细胞，在炎症反应中起着重要作用，内皮细胞功能紊乱不仅仅是心血管损伤的早期表现，而且在整个内皮损伤过程中起着重要作用。循环内皮细胞是内皮损伤的标志物，血液中循环内皮细胞增加往往意味着更高的心血管损伤风险。我们先前的研究发现川崎病患儿循环内皮细胞增加，循环内皮细胞上S100A12及其受体RAGE表达增加，而且这种增加在有冠状动脉损伤的患儿中更为明显，但S100A12与RAGE在川崎病心血管病变中的的作用与机制有待于进一步明确。CRP是一种急性期蛋白，在多种炎症疾病中会反应性增高，许多研究证实CRP不仅是一种炎症因子，而且直接参与了内皮损伤的过程，川崎病急性期有普遍的CRP水平升高，而且有较高水平CRP的患儿罹患冠状动脉损伤的风险更高。有研究证实CRP与RAGE有密切联系，CRP能诱导内皮RAGE的表达升高，而且RAGE可能参与了CRP诱导的细胞损伤，但CRP与RAGE之间的关系仍然有待进一步研究证实。　　 目的:　　 用不同浓度的重组人S100A12蛋白或人血浆来源的CRP作用于培养的人冠状动脉内皮细胞，观察不同浓度组循环内皮细胞数量的变化，比较S100A12或CRP作用对循环内皮细胞数量的影响。建立小干扰RNA（siRNA）干扰RAGE表达，观察RAGE沉默是否能抑制CRP诱导的循环内皮细胞变化。　　 方法:　　 人冠状动脉内皮细胞购自ATCC（美国模式菌种收集中心），4-6代细胞用于所有实验。　　 第一部分:CRP或S100A12对循环内皮细胞数量的影响　　 分别用不同浓度的CRP（0，12.5，25，50μg/ml）或者S100A12(0，4，10，25μg/ml)与人冠状动脉内皮细胞共同孵育24h，收集细胞，测定不同浓度CRP或S100A12作用内皮细胞24h后，各浓度组循环内皮细胞的数量。循环内皮细胞数量测定采用流式细胞术，用anti-CD146-FITC，anti-CD105-APE，anti-CD45-Percp-cy5.5，anti-CD34-PE染色细胞，筛选CD146(+)，CD105(+)，CD45(-)，CD34(+)为循环内皮细胞，每组实验重复4次。　　 第二部分:RAGE小干扰RNA（siRNA）的建立　　 设计合成3条siRNA用于沉默内皮细胞RAGE表达，另外设计了FITC标记的siRNA-GADPH作为阳性对照，用于检测siRNA转染效率，以及无效siRNA作为对照组，用于检测siRNA沉默RAGE效率。转染试剂为Lipofectamine2000Transfection Reagent，待细胞长至40％左右开始进行转染。　　 (1) siRNA转染人冠状动脉内皮细胞效率检测:　　 用FITC标记的内参siRNA-GADPH转染细胞6h后，除去培养基，用PBS液洗细胞3次后，Hoechst室温避光染色30min，再洗涤细胞3次，荧光显微镜观察红色荧光和蓝色荧光，计算转染成功细胞百分比。　　 (2) siRNA沉默人冠状动脉内皮细胞RAGE表达检测　　 分别用siRNA1、siRNA2、siRNA3转染细胞，并用无效siRNA作为对照组，48h后相对定量Real-time PCR检测细胞mRNA水平上RAGE表达，每组实验重复3次。　　 第三部分:RAGE干扰RNA抑制了CRP诱导的循环内皮细胞增加　　 25μg/ml浓度的CRP分别作用于人冠状动脉内皮细胞和RAGE沉默（siRNA作用24h）后的人冠状动脉内皮细胞，并设立空白及对照组，比较不同组循环内皮细胞数量的变化，每组实验重复4次。　　 结果:　　 第一部分:CRP诱导了循环内皮细胞的释放，但S100A12未能诱导循环内皮细胞释放　　 1.不同浓度S100A12与内皮细胞共孵育24h对循环内皮细胞释放的影响　　 与对照组相比，S100A12作用后，各浓度组循环内皮细胞数量差异较小。各S100A12（0，4，10，25μg/ml）浓度组循环内皮细胞百分比值分别为:11.97±4.16％，11.08±6.02％，10.91±3.16％，9.66±0.64％，各组差异无统计学意义。　　 2.不同浓度CRP与内皮细胞共孵育24h对循环内皮细胞释放的影响　　 与对照组相比，CRP作用后，循环内皮细胞数量均增加，存在一定浓度依赖关系，当CRP浓度＞25μg/ml时，循环内皮细胞数量显著增加。各CRP(0，12.5，25，50μg/ml)浓度组循环内皮细胞百分比值分别为:6.82±1.64％，9.66±3.39％，12.22±3.33％，12.47±4.25％。与对照组相比25μg/ml及50μg/ml组差异有统计学意义。　　 第二部分:RAGE小干扰RNA(siRNA)的建立和检测　　 1.约＞80％细胞成功转染siRNA　　 2.与对照组相比，siRNA1、siRNA2、siRNA3均能在mRNA水平上沉默RAGE表达，siRNA2沉默效率最高，波动最小，各siRNA干扰组(siRNA1、siRNA2、siRNA3)与对照组比较，mRNA水平上RAGE表达百分比分别为:0.53±0.16，0.34±0.08,0.45±0.20。　　 第三部分:siRNA抑制了CRP诱导的循环内皮细胞释放　　 siRNA沉默RAGE抑制了CRP诱导的循环内皮细胞增加，各组循环内皮细胞百分比值分别为:空白组10.39±2.93％，对照组:9.28±6.40％，CRP组:13.22±2.64％，CRP+siRNA组:8.77±2.16％。CRP组与对照组差异有统计学意义，CRP+siRNA组与CRP组差异有统计学意义。　　 结论:　　 (1) CRP诱导了人冠状动脉内皮细胞来源的循环内皮细胞释放。　　 (2)成功建立了人冠状动脉内皮细胞RAGE基因小干扰RNA（siRNA）。　　 (3) RAGE参与了CRP诱导的循环内皮细胞释放。