论文部分内容阅读
大菱鲆（Scophthalmus maximus）隶属蝶形目（Pleuronectiformes）,鲆科（Bothidae）,又名多宝鱼,是低温经济鱼类中的名贵品种,其养殖最早源于欧洲。鱼类无水保活是通过采用缓慢降温法使其进入休眠状态后,捞出水环境中进行无水充氧密封包装,并在冰温环境中贮藏,达到时间后,移至适宜的低温水环境中进行梯度升温使其缓慢进入正常生存状态。大菱鲆是研究无水保活技术的理想材料,然而在整个过程中各种因素对机体的作用机制尚未明确。因此,本研究运用生物化学、蛋白质组学、组织学和转录组学等技术方法,探索了无水保活前处理缓慢降温冷驯化与保活过程中不同氧气浓度对大菱鲆机体的作用机制。在此基础之上,研发了大菱鲆无水保活运输集装箱。主要研究结果如下:1.大菱鲆经冷驯化之后,血糖、ATP、皮质醇以及CAT、溶菌酶、SOD、AKP、ACP活性均呈现显著上升趋势;GOT和GPT活性则显著下降。经二维蛋白电泳分析,总计筛选出16个与大菱鲆生理机能相关的差异表达蛋白,其中包括 Tudor domain-containing protein 7-like、Uncharacterized protein C9orf93-liike、Pericentrin 等 8 个上调表达蛋白,brain creatine kinase、Serine/threonin protein kinase ARAF、Actin,alpha,cardiac muscle la 等 8 个下调表达蛋白。经 real-time qPCR 检测分析发现,pericentrin、beta-enolase与Enolase 1,（alpha）3个蛋白的基因表达量呈现显著上调;complement component c3b,tandem duplicate 1 precursor、claudin-10A、phosphoglycerate mutase 2 与 brain creatine kinase 4 个蛋白的基因表达量呈现显著下调。2.在大菱鲆无水保活过程中,不同氧气浓度处理后6h和12 h时的鳃丝进行了组织学观察,结果表明,空气处理组（A组）鳃丝中鳃小片形态变化明显,均出现收缩、折皱现象。同时,测量了鳃小片其基部厚度、长度、周长和横断面积。与CK组相比,氧气处理组（O组）仅周长在无水保活6 h时显著增加（P<0.01）,达到（356.29±32.76）μm 12h时又恢复到正常值水平;空气处理组（A组）的基部厚度、周长和横断面积均发生显著性差异（P<0.05）,长度值无显著性差异（P>0.05）。空气处理组（A组）在无水保活12h时降低至（2.96±0.048）μmol/g显著低于对照组（CK）（P<0.05）。空气处理组（A组）在无水保活6h与12h时,大菱鲆血清中葡萄糖浓度、皮质醇含量、血清尿素氮浓度均显著升高,差异极显著（P<0.01）,两处理组大菱鲆血清CHE（胆碱酯酶）浓度在整个无水保活过程中均无显著性差异。3.为系统了解无水保活过程中氧气浓度对大菱鲆鱼鳃组织影响的转录组特征,选取了缓慢降温至2 ℃作为对照组,空气处理组（A组）与氧气处理组（O组）的鱼鳃,共构建了 9个cDNA测序文库。测序共得到59 Gb数据,总长度168973791 bp,平均长度为 1611 bp,N50 为 3127 bp,GC 含量 49.41%。经过小片段去除和质量筛查后,高质量的序列经过拼接组装得到的104886条Unigenes,最大Unigene为23178bp,最小值为201 bp。将得到的104886条Unigenes与NCBI的Nr经blast比对,NR中的65000个（62.3%）独立基因、NT中的78000个（74.9）独立基因、Swissprot蛋白序列数据库中59000个（55.9%）独立基因、COG中28000个（26.7%）独立基因、KEGG中58000个（54.4%）独立基因、GO中6000个（6.0%）独立基因和Interpro中48000个（45.9%）独立基因获得功能注释。经七大数据库比对后,共有81186条Unigenes获得了注释,占总数的77.40%。104886条Unigenes被注释到25个不同功能家族中,经比对发现涉及General function prediction only功能的基因最多有10219条Unigenes,其次是Transcription 功能有 4771 条 Unigenes,然后 Replication recombination and repair功能有4725条Unigenes涉及为了进一步对Unigenes描述,对于获得的Unigenes进行GO注释。在生物学过程中关于cellular process Unigenes最多为3225条,占3.07%。细胞组分中关于cell功能的Unigenes有2445个,占总的2.33%。分子功能中bing类有2964条Unigenes,占比最多为2.83%。利用RPKA值差异显著性（P<0.05）分别两两计算不同组差异基因表达量,并用2-fold法进行数据统计和分析不同组之间的差异基因。A组和O组总共获得647个差异表达基因,其中435个基因显著上调,212个基因显著下调;对照组和空气组共获得662个差异表达基因,其中322个差异基因显著上调,340个差异基因显著下调;对照组和氧气组总共获得441个差异基因,其中244个差异基因显著上调,197个差异基因显著下调。对照组与氧气组之间的差异基因数量（441）远少于对照组和空气组之间的差异基因数量（662）,同时也少于空气组与氧气组之间的差异基因数（647）,这说明氧气比空气更有利于大菱鲆的保活运输。4.为了使大菱鲆无水保活运输工艺技术能够得到实际应用,在前期工艺技术探究的基础之上,设计研发了大菱鲆无水保活运输集装箱。集装箱主要由硬件设备与软件监控系统两大组成部分。硬件设备包括柴油发电机组、制冷机组、氧气浓度探测器、二氧化碳浓度探测器、进气电磁阀等。软件监控系统包括可编程控制器（PLC）、温度监控系统、氧气浓度监控系统、二氧化碳浓度监控系统、压力与湿度检测系统组成。利用触摸屏实现对保活运输集装箱厢体内温度、氧气浓度、二氧化碳浓度的监测与调控,湿度与压力的监测。