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类风湿性关节炎(RA)是一种发病机制复杂,发病原因尚未明确的慢性自身免疫性疾病。该病以小关节的滑膜炎症为主,伴随全身性脏器损伤,甚至导致患者残疾,影响患者的生活质量和寿命。该病在世界范围内均有相关病例报道,影响全球1%人口,且发病率随年龄升高而增加。临床上用于治疗RA的传统药物存在不良反应大、适应症窄、靶向性差等问题,因此开发新的治疗RA的生物药物是一项重要的工作。近年来以T细胞、B细胞、细胞因子和粘附因子等为靶点的生物制剂在RA的治疗上表现出高效、安全的特性,因此越来越受到关注。RA的发病机制十分复杂,目前发现自身反应性T淋巴细胞的过度活化在RA的发病过程中发挥重要作用。RA发病早期自身抗原被抗原递呈细胞携带到淋巴器官激活T细胞,导致淋巴器官的炎症反应。激活后异常扩增的T细胞选择性进入关节,被关节抗原激活后,导致关节的病理损伤。T细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-17A促进成纤维样滑膜细胞分泌趋化因子和细胞因子,还促进血管翳的形成,刺激骨吸收,导致关节软骨损伤,加重关节损伤程度。RA患者出现异常病理反应的同时,机体内代谢调节出现紊乱,而且形成低氧和营养物质匮乏的微环境,在RA患者的血清和滑液中均已发现了糖脂代谢产物水平异常的证据。另外在RA免疫系统建立和维持慢性炎症的过程中,低氧和低营养环境下的T细胞通过调节代谢活动来维持功能,其被自身抗原激活后表现为糖酵解和磷酸戊糖途径增强,脂肪酸代谢异常。其中糖酵解产物乳酸抑制T细胞运动,并使T细胞分泌大量IL-17A,促进关节的慢性炎症过程。磷酸戊糖途径产物R5P为T细胞增殖提供更充分的前体,产物NADPH为T细胞生物合成反应提供更多的还原力。T细胞中有大量脂肪酸堆积,这种脂肪酸代谢的异常参与炎症反应的发生。B7家族免疫检查点共抑制分子下调T细胞免疫应答,保持外周的自我耐受,参与RA的疾病发展过程。PD-L1和PD-L2是PD-1的配体,通过传递抑制信号,调节T细胞活化、耐受和免疫介导的组织损伤,且在不同程度上参与RA的免疫和疾病发展过程。B7H4在抗原递呈细胞上诱导表达,与T细胞表面受体结合后,抑制T细胞增殖和炎性因子产生,且其基因敲除小鼠的关节炎病症加重。VISTA可以作为T细胞的配体和受体发挥抑制作用,且对初始T细胞活性的抑制作用比记忆性T细胞更敏感,其在自身免疫疾病中的潜在作用日益受到关注。RA的临床治疗需要更高效、安全的生物制剂药物,由于过度活化的自身反应性T细胞在RA疾病进程中有重要作用,B7家族免疫检查点分子调控T细胞免疫反应,且参与RA的疾病发展过程,本课题通过构建胶原诱导性关节炎(CIA)模型小鼠,研究B7家族融合蛋白对CIA小鼠的药效作用,对CIA小鼠免疫反应和代谢的影响,及对抗原特异性T细胞糖酵解,磷酸戊糖和脂肪酸代谢的调节作用,旨在为治疗RA的候选免疫调节药物的研发提供实验和理论依据。研究方法:1.利用基因工程技术获得B7家族融合蛋白,并建立CIA模型小鼠。2.CIA小鼠经B7家族融合蛋白治疗后,进行临床评分,发病率统计和病理组织学分析,ELISA及微量法检测外周血中炎性细胞因子TNF-α、IL-17A和糖代谢产物LA的含量。3.CIA小鼠的T细胞被CⅡ刺激后,用B7家族融合蛋白VISTA-Ig和PD-L2-Ig处理抗原特异性T细胞,ELISA法检测抗原特异性T细胞分泌炎性细胞因子TNF-α和IL-17A的含量。4.融合蛋白VISTA-Ig和PD-L2-Ig处理抗原特异性T细胞,微量法检测T细胞中糖代谢关键酶HK、LDH、G6PDH和产物LA、NADPH的含量,qRT-PCR法检测转录因子HIF-1α的相对表达量。5.融合蛋白VISTA-Ig和PD-L2-Ig处理抗原特异性T细胞,微量法检测脂肪酸代谢物NEFA的含量,qRT-PCR法检测转录因子TFEB的相对表达量。研究结果:1.B7家族融合蛋白有效降低CIA模型小鼠的发病率、发病程度和临床评分,减少关节中的软骨损伤和血管翳形成状况。2.B7家族融合蛋白降低CIA小鼠外周血中炎性细胞因子TNF-α、IL-17A和糖代谢物LA的含量。3.融合蛋白VISTA-Ig和PD-L2-Ig降低抗原特异性T细胞炎性细胞因子IL-17A的分泌,且融合蛋白VISTA-Ig降低抗原特异性T细胞炎性细胞因子TNF-α的分泌。4.融合蛋白VISTA-Ig和PD-L2-Ig降低抗原特异性T细胞中糖酵解关键酶HK、LDH和产物LA的含量,降低抗原特异性T细胞中磷酸戊糖途径关键酶G6PDH的含量,趋向于降低产物NADPH的含量,而且减少抗原特异性T细胞中调控糖代谢的转录因子HIF-1α的相对表达量。5.融合蛋白VISTA-Ig和PD-L2-Ig影响脂肪酸代谢物NEFA的含量和脂肪酸代谢相关转录因子TFEB的相对表达量。研究结论:本研究发现B7家族融合蛋白减轻CIA小鼠的疾病严重程度,调节CIA小鼠异常的免疫和代谢状态。B7家族融合蛋白可能通过调控抗原特异性T细胞糖酵解,磷酸戊糖和脂肪酸代谢,影响T细胞的免疫功能,发挥对CIA小鼠的治疗作用。本研究评估了 B7家族融合蛋白对CIA小鼠关节炎的治疗作用,并对其治疗CIA的作用机理进行了初步研究,为治疗RA的候选免疫调节药物的研发提供实验和理论依据。