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水稻病毒如南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）、水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）、水稻锯齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus,RRSV）,水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus,RGDV）和水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus,RDV）等均由介体昆虫飞虱或叶蝉以持久增殖型方式传播。在介体昆虫内的侵染循回过程中,这些水稻病毒随植物汁液通过昆虫食道到达中肠肠腔,侵入中肠上皮细胞,在其中复制增殖后扩散到肌肉外层并释放到血淋巴,接着侵入唾液腺,再从唾液腺释放到口针,最后在昆虫取食时传播给寄主植物。因此,这类病毒在介体内从消化道到唾液腺循环过程中不仅需克服介体各种组织系统和膜的屏障,还需克服昆虫的天然免疫屏障。这些屏障极大地影响介体昆虫与病毒之间的亲和性。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是昆虫等生物保守的抵御病毒等病原物侵染的免疫防御机制。但是,目前仍未阐明介体昆虫叶蝉和飞虱RNAi途径是否能有效调控介体昆虫传播水稻病毒的能力,从而影响介体昆虫与水稻病毒的亲和性;也并不明确RNAi途径是否调控水稻病毒持久侵染的建立、维持以及有效传播。本研究主要针对介体昆虫叶蝉和飞虱RNAi免疫与水稻病毒的持久侵染、介体亲和性的关系进行了探索。1、siRNA途径调控SBPH传播SRBSDV的能力在自然界,介体昆虫传播病毒能力的差异普遍存在。先前的研究发现,SRBSDV由白背飞虱高效传播。SRBSDV虽然在灰飞虱可以适度的增殖,但是该病毒无法突破中肠释放屏障,使得灰飞虱无法传播该病毒。证据表明昆虫RNAi途径调控了虫传病毒在中肠的侵染率、积累量和扩散率。但是目前RNAi途径是否调控SRBSDV在白背飞虱、灰飞虱体内的持久增殖从而调控介体与病毒的亲和性差异未见报道。首先,为了明确SRBSDV在灰飞虱体内受到的屏障,利用显微注射技术将SRBSDV注射到灰飞虱和白背飞虱体腔,免疫荧光和RT-qPCR技术观察SRBSDV在两种飞虱体内的侵染、增殖和扩散情况。结果表明,在注射病毒后5、8、11和15 d,与对照白背飞虱相比,SRBSDV在灰飞虱体中肠和唾液腺的侵染、增殖和扩散速率较低,导致灰飞虱传播SRBSDV效率较低、时间较长。因此,我们推测SRBSDV在灰飞虱体内受到中肠和唾液腺组织屏障的限制,其中中肠屏障占主导地位,还可能受到灰飞虱免疫屏障的调控。其次,为了明确灰飞虱RNAi免疫反应是否调控灰飞虱与SRBSDV之间的亲和性或者灰飞虱传播SRBSDV的能力,首先通过small RNA深度测序发现,SRBSDV侵染灰飞虱中肠上皮细胞及其培养细胞能够诱导产生大量病毒来源的主要长度为 22 nt 的小干扰 RNA（Viral-derived small interference RNAs,vsiRNAs）,这初步暗示SRBSDV能够诱导灰飞虱RNAi免疫反应;接着在灰飞虱培养细胞和昆虫体内分别通过转染和注射siRNA（Small interference RNA）途径中 Dicer2 基因双链 RNA（Double stand RNA of Dicer2,dsDicer2）沉默 Dicer2 基因的表达后,免疫荧光、RT-qPCR和small RNA深度测序结果表明,SRBSDV在灰飞虱培养细胞的侵染水平显著提高,SRBSDV来源的vsiRNAs在中场上皮细胞中的积累量显著减少、SRBSDV在灰飞虱中肠上皮细胞中的积累水平明显增加,当SRBSDV外壳蛋白P10基因拷贝数达到约1.99 × 109 copies/μg miggut RNA时,SRBSDV可以突破灰飞虱中肠释放屏障、扩散到中肠肌肉外层、侵染唾液腺并完成传毒,因此,灰飞虱siRNA抗病毒途径调控了灰飞虱与SRBSDV之间的亲和性。此外,为了明确亲和性介体白背飞虱体内的siRNA途径是否调控SRBSDV的持久侵染,通过免疫荧光、RT-qPCR和small RNA深度测序表明,在白背飞虱培养细胞干扰Dicer2基因的表达能够提高SRBSDV在培养细胞的侵染;在白背飞虱体内干扰Dicer2基因表达后,显著抑制vsiRNA的产生、提高SRBSDV在亲和性的白背飞虱体内积累水平,最终导致白背飞虱大量死亡。因此,亲和性介体昆虫的siRNA途径具有限制SRBSDV过多的积累,从而避免病毒对昆虫造成伤害的功能。虽然灰飞虱和白背飞虱DCR2蛋白都能在siRNA抗病毒途径中调控SRBSDV的持久增殖,但是SRBSDV与这两种飞虱亲和性仍存在较大差异。通过比较灰飞虱和白背飞虱DCR2蛋白氨基酸保守序列后发现,两者的氨基酸序列的相似性约为84%（资料未显示）,因此SRBSDV与两种飞虱亲和性差异可能和两种飞虱DCR2蛋白的分子变异存在直接的关系。只是目前由于半翅目昆虫无法执行转基因等技术的操作,我们并不能在白背飞虱体内直接证明灰飞虱DCR2蛋白的具体功能。因此,本研究明确了 siRNA抗病毒免疫反应发挥何种作用决定于病毒-昆虫系统的特殊性,当病毒-昆虫亲和性较低时,其在调控介体昆虫与植物病毒亲和性中发挥重要作用,当病毒-昆虫亲和性较高时,其具有控制病毒的过多积累,避免病毒对昆虫造成不利影响的作用。2、siRNA途径调控RGDV在电光叶蝉体内的持久增殖和有效传播持久增殖型病毒更适合于寄生在介体昆虫细胞中,可在介体昆虫中大量增殖而不表现病症,暗示昆虫的天然免疫系统可以调控病毒的持久增殖并与之“和平共处”。但是,其中的具体机制未见报道。RGDV由介体电光叶蝉高效、持久增殖方式传播。本研究试图以RGDV-电光叶蝉为病原系统明确昆虫siRNA途径是否调控RGDV在介体昆虫电光叶蝉体内的持久增殖以及传播。本研究首先通过small RNA深度测序和RT-qPCR表明,RGDV侵染介体昆虫电光叶蝉后产生病毒来源的主要长度为21 nt的vsiRNAs,RGDV诱导上调了 siRNA途径中Dicer2和Argonaute2基因的表达水平;免疫荧光、RT-qPCR和电镜结果表明,在昆虫体内及其培养细胞中干扰Dicer2基因的表达能够显著抑制vsiRNAs的产生,提高RGDV在昆虫体内及其培养细胞中的积累水平;病毒外壳蛋白P8基因拷贝数达到1.32 × 1014copies/μg insect RNA的阈值时引起昆虫细胞发生细胞质空泡化、细胞质电子密度降低、微绒毛脱落、线粒体和内质网等细胞器降解以及胞间连接复合物缺损等一系列严重的病理学变化,进而导致约55%的昆虫死亡。病毒低于该阈值时,病毒的持久侵染将得以建立与维持,病毒与昆虫能够“和平共处”;病毒高于该阈值时,病毒在大部分昆虫体内的持久侵染转变为致死侵染。因此,本研究揭示了介体昆虫在进化过程中通过激活昆虫siRNA抗病毒免疫反应来调控病毒复制增殖与其致病程度达到一种平衡,从而使得病毒能够在介体内持久增殖并被介体有效地传播。3、siRNA途径调控其他水稻病毒在介体昆虫体内的持久侵染为了明确其他介体昆虫的siRNA途径是否调控水稻病毒在其体内的持久侵染,通过免疫荧光、RT-qPCR和small RNA深度测序表明,在黑尾叶蝉虫体内及其培养细胞中干扰siRNA途径Dicer2和Argonaut2基因的表达抑制21 nt长的vsiRNAs的形成、促进RDV在昆虫体内及其培养细胞中的侵染率、增殖水平,提高黑尾叶蝉获得和传播RDV的效率,从而提高黑尾叶蝉与RDV之间的亲和性。此外,通过免疫荧光和RT-qPCR分析表明,在灰飞虱体内干扰Dicer2基因的表达能够提高RSV和Himetobi P virus（HiPV）在其体内的侵染与增殖,因此,本研究进一步证实了在水稻病毒的传播介体叶蝉和飞虱体内普遍存在siRNA抗病毒活性。综上所述,本研究利用昆虫培养细胞体系、RNA silencing、免疫荧光、电镜、small RNA deep sequencing和RT-qPCR等创新性技术体系明确了 SRBSDV在灰飞虱体内受到中肠屏障、唾液腺屏障和免疫屏障;明确了水稻病毒的介体昆虫体内普遍存在RNAi抗病毒免疫反应,且该抗病毒免疫反应中发挥功能的主要蛋白因子为Dicer2和Argonaute2;揭示RNAi反应中的siRNA途径调控SRBSDV与介体昆虫亲和性差异或者介体昆虫传播SRBSDV能力差异的分子机制;揭示RNAi反应中的siRNA途径调控RGDV在电光叶蝉体内持久增殖、致病、昆虫与病毒能“和平相处”的分子机理。这些研究有助于探索新的阻断介体昆虫传播病毒的新策略,为防治病毒病的发生奠定理论基础。