研究背景：结核病（Tuberculosis，TB）一直是一个备受关注的全球性健康问题，迄今为止，关于结核病的发病机制，特别是机体对结核感染的免疫机制并未完全阐明。近年来，具有天然免疫样作用的γδ T细胞在结核感染中的免疫作用，已经得到众多研究者的实验研究和临床观察的证实。IL-17是一种重要的促炎性细胞因子，近年来研究感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）以及卡介苗感染的小鼠模型发现，分泌IL-17的细胞主要来源于γδ T细胞。本实验室前期研究发现，在正常人外周血中存在产生IL-17的γδ T细胞,而且这些细胞在结核病患者外周血中是增高的，提示产生IL-17的γδ T细胞可能涉及TB的发病过程。虽然有研究指出，人γδ T细胞在磷酸化抗原刺激下加入诱导性的细胞因子诱导培养，也可以诱导分泌IL-17，但Mtb多肽类抗原如Mtb耐热抗原（Mtb-HAg）和多克隆抗体如抗TCR-γδ抗体刺激人γδ T细胞后对极化细胞因子诱导分化γδ T细胞产生IL-17有何作用和影响尚不清楚。另外，诱导人γδ T细胞分化的培养条件的研究，以及产生IL-17的健康人γδ T细胞属于何种亚群，也有待进一步探讨。目的：探讨Mtb耐热抗原（Mtb-HAg）和抗TCR-γδ抗体在刺激人γδ T细胞诱导分化产生IL-17中的作用。检测和分析健康人γδ T细胞的不同亚群经诱导极化后产生IL-17有何不同，以探讨健康人γδ T细胞不同亚群产生IL-17的作用。方法：1.采集健康人外周血单个核细胞（PBMC）经过免疫磁珠分选得到纯化的γδ T细胞后，加入Mtb-HAg或包被的抗TCR-γδ纯化抗体，再加或不加CD28单抗进行刺激，同时加或不加IL-17极化细胞因子组合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）诱导培养10-12d。然后收集诱导极化培养的γδ T细胞，经PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法检测产生IL-17的细胞数。2.采集健康人外周血浓缩白细胞（buffy coat cell）分离PBMC后冷冻保存。取冻存的PBMC复苏后经MACS得到纯化的γδ T细胞，用含10%NBS或人AB血清的IMDM培养液或RPMI-1640培养液进行培养，每孔均加入抗TCR-γδ抗体，CD28单抗以及IL-17极化细胞因子组合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）诱导培养。培养10-12d时，收集诱导极化培养的γδ T细胞，经PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法检测不同培养液培养下产生IL-17的细胞数。3.复苏经冻存的健康人的PBMC，免疫磁珠分选法分选γδ T细胞，得到Vδ2+γδ T细胞和Vδ2–γδ T细胞两个亚群，用含10%人AB血清的IMDM培养液细胞浓度后加入抗TCRγδ抗体、CD28单抗以及IL-17极化细胞因子组合（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）诱导培养10-12d，收集细胞，经PMA和Ionomycin再刺激6h后，用ELISPOT的方法检测γδ T细胞两个亚群产生IL-17的细胞数。结果：1、经刺激和诱导分化培养的γδ T细胞用ELISPOT方法检测产生IL-17的细胞数（每105个γδ T细胞）发现，抗TCR-γδ+CKs组（67±33）比抗TCR-γδ组（6±3）比明显增加（P＜0.01），抗TCR-γδ+CD28单抗+CKs组（185±54）与抗TCR-γδ+CKs组（67±33）比明显增多（P＜0.01）。Mtb-HAg+CD28单抗+CKs组（74±41）与抗TCR-γδ+CD28单抗+CKs组（185±54）比显著减少，但与Mtb-HAg+CD28单抗组（19±12）比明显增多（P＜0.05）。2、纯化的γδ T细胞用含10%NBS的RPMI-1640或IMDM作为培养液进行培养，在相同的诱导极化条件下培养10-12d后ELISPOT检测发现，用IMDM培养液培养的组（333±46）产生IL-17的γδ T细胞数（每105个γδ T细胞）与用RPMI-1640培养液的组（56±38）比明显增多（P＜0.01）。3、来源于新鲜的PBMC或冻存的PBMC经免疫磁珠分选得到的γδ T细胞在相同的诱导培养条件下培养10-12d后ELISPOT检测，来源于新鲜的PBMC经纯化后得到的γδ T经诱导极化产生IL-17的量明显高于比来源于冻存的PBMC（P＜0.01）。4、复苏冻存的PBMC后免疫磁珠分选得到纯化的γδ T细胞，分别用含10%NBS的IMDM培养液和含10%人AB血清的IMDM培养液培养，在相同的诱导极化培养条件下培养10-12d后ELISPOT检测发现，含人AB血清的培养液组与含10%NBS的培养液组相比明显增多（P＜0.01）。5、培养后Vδ2－γδ T细胞中Vδ3-8亚群所占比例＞50%时，Vδ2－γδ T细胞产生IL-17的细胞数（1537±1193）与Vδ2+γδ T细胞（579±420）相比明显增多（P＜0.05）。而培养后Vδ2－γδ T细胞中Vδ3-8亚群所占比例＜50%时，Vδ2－γδ T细胞产生IL-17的细胞数（491±745）与Vδ2+γδ T细胞（1729±1315）相比明显减少（P＜0.01）。结论：1、在正常健康人γδ T细胞经Mtb-HAg或抗TCR-γδ抗体激活后，诱导Th17分化的细胞因子（IL-1β，IL-6，TGF-β和IL-23）也能诱导IL-17+γδ T细胞分化。CD28在协同抗TCR-γδ抗体激活γδ T细胞诱导产生IL-17的过程中也有重要作用。2、抗TCR-γδ抗体刺激诱导IL-17+γδ T细胞分化比Mtb-HAg的作用更强。3、诱导人γδ T细胞产生IL-17时用IMDM培养液培养可产生更多的IL-17+γδ T细胞，提示其与芳香烃受体的参与有关。4、在正常人外周血γδ T细胞中产生IL-17的细胞主要以Vδ3-8亚群为主，其次为Vδ2亚群，Vδ1亚群中最少。