论文部分内容阅读
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的以运动障碍为主要特征的神经退行性疾病,其病理特征主要表现为中脑黑质区致密带多巴胺能神经元发生退变、α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）异常聚积形成路易小体以及铁沉积等。目前我国有超过200万的PD患者,据世界卫生组织预测,随着人口老龄化加剧,到2030年该数字预计将激增到500万,占世界PD患者总数的一半以上。虽然年龄、环境和遗传因素均参与PD发病,但其确切的机制尚未完全阐明。铁死亡（ferroptosis）是2012年在Cell杂志上首次报道的一种新型细胞死亡方式,其主要的生化特征包括铁离子聚集,还原性谷胱甘肽耗竭和细胞膜脂质过氧化物的累积等,而这些特征很早就在PD患者尸检报告中发现。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD小鼠模型和过表达A53T突变型α-syn的转基因小鼠模型均发现了铁死亡现象,而且铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）可显著抑制MPTP对DA能神经元的毒性,提示铁死亡可能参与PD黑质区致密带DA能神经元退变,但是作为PD的核心致病因素,α-syn聚集在铁死亡过程中的作用机制尚不清楚。在本课题中,我们选取了三种不同的PD动物模型:（1）过表达A53T突变型α-syn(SNCAA53T)的转基因小鼠模型（以下简称为A53T模型小鼠）,（2）脑立体定位注射携带SNCAA53T基因的腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）至黑质区所构建的AAVSNCA（A53T）大鼠模型(以下简称为AAVSNCA（A53T）模型大鼠),（3）鱼藤酮诱导的PD小鼠模型（以下简称为鱼藤酮模型小鼠）,以及过表达SNCAA53T的细胞模型（inducible PC12,i PC12）。在上述PD动物和细胞模型,分别检测了过表达α-syn对铁死亡的影响,并在AAVSNCA（A53T）大鼠模型上,采用多组学（蛋白组学、磷酸化蛋白组学和转录组学）、生物信息学和分子生物学相结合的方法,筛选并验证了α-syn调控铁死亡的可能激酶。具体实验结果如下:1、与野生型小鼠黑质区相比,免疫印迹结果显示,在A53T小鼠黑质区,伴随着α-syn的过表达（P<0.01,n=6）,谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）蛋白水平显著下降（P<0.01,n=6）;在AAVSNCA（A53T）大鼠模型,脑立体定位注射AAV四周后免疫荧光结果显示,黑质区α-syn表达升高,同时免疫印迹结果显示,与注射空载病毒的右侧黑质区相比,左侧黑质区GPX4蛋白水平明显下降（P<0.01,n=6）;在鱼藤酮小鼠黑质区,铁染色结果显示黑质区出现明显的铁沉积,同时免疫印迹结果显示,与对照组小鼠相比,鱼藤酮小鼠黑质区GPX4蛋白水平显著下降（P<0.05,n=6）。2、在i PC12细胞上,采用多西环素（doxycycline,DOX,2μg/m L）处理24 h,诱导α-syn过表达。免疫印迹结果显示,与对照组相比,DOX处理组伴随着α-syn过表达（P<0.001）,GPX4蛋白水平显著下降（P<0.05）。3、为探讨α-syn调控铁死亡的作用及机制,我们取AAV SNCA（A53T）大鼠黑质区脑组织,分别进行蛋白组学、磷酸化蛋白组学和转录组学检测,并通过生物信息学分析,筛选出包括PKC、MAPK、CK2、CK1、AGC、DYRK和CAMKL七个家族的30蛋白激酶,上述蛋白激酶活性显著升高,提示其可能参与过表达α-syn调控铁死亡的过程。4、为了验证蛋白激酶功能,我们在PC12细胞上用DOX诱导α-syn过表达后,通过siRNA干扰技术分别干扰上述30个激酶的表达,最后通过免疫印迹检测GPX4蛋白水平的变化。结果如下:（1）与对照组相比,分别干扰DYRK家族的激酶Hipk2、Dyrk1a和Dyrk1b后,GPX4蛋白水平均显著下降（P<0.05,P<0.01）;分别干扰该家族的激酶Hipk1和Hipk4后,GPX4蛋白水平均显著上升（P<0.05,P<0.01）;干扰激酶Dyrk3后,GPX4蛋白水平无明显变化。（2）与对照组相比,分别干扰PKC家族的激酶Prkcz、Prkcb和Prkcd后,GPX4蛋白水平均显著下降（P<0.05,P<0.01）;干扰该家族的激酶Prkch和Prkci后,GPX4蛋白水平显著上升（P<0.05,P<0.01）;分别干扰激酶Prkca、Prkce、Prkcg和Prkcq后,GPX4蛋白水平无明显变化。（3）与对照组相比,分别干扰CK1家族的激酶Csnk1g2和Ttkk2后,GPX4蛋白水平显著下降（P<0.05）;干扰该家族的激酶Csnk1g1后,GPX4蛋白水平显著上升（P<0.05）;分别干扰激酶Csnk1e、Csnk1d、Ttbk1、Vrk2和Vrk3,GPX4蛋白水平无明显变化。（4）与对照组相比,干扰MAPK家族的激酶Mapk15后,GPX4蛋白水平显著下降（P<0.05）;干扰该家族的激酶Mapk4后,GPX4蛋白水平无明显变化。（5）与对照组相比,分别干扰CK2家族的激酶Csnk2a1和Csnk2a2后,GPX4蛋白水平无明显变化。（6）与对照组相比,分别干扰CAMKL家族的激酶Brsk2和Mark2后,GPX4蛋白水平无明显变化。（7）与对照组相比,干扰AGC家族的激酶Stk32a后,GPX4蛋白水平无明显变化。在上述siRNA干扰实验中,干扰激酶Hipk2对GPX4蛋白水平影响最为明显,乳酸脱氢酶（LDH）结果显示,与对照组相比,干扰Hipk2后,细胞的LDH释放明显升高（P<0.01,P<0.001）。综上所述,在遗传因素(A53T模型小鼠和AAVSNCA（A53T）模型大鼠)和环境因素（鱼藤酮模型小鼠）三个PD动物模型的黑质区均观察到铁死亡相关蛋白GPX4显著下降,同时在过表达α-syn的细胞模型也检测到GPX4显著下降,提示过表达α-syn可诱导铁死亡。多组学、生物信息学和分子生物学的结果显示,DYRK家族激酶Hipk2、Dyrk1a、Dyrk1b、Hipk1和Hipk4以及PKC家族的蛋白激酶Prkcz、Prkcb、Prkcd、Prkci和Prkch可能参与α-syn诱发铁死亡。