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背景随着饮食结构的西方化和体力活动的减少，糖尿病患者在发展中国家迅速增加，其增长速度是发达国家的2—3倍。糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，约40％的糖尿病患者最终合并肾脏病变。在美国，糖尿病肾病是终末期肾病的首位原因，占每年新发病例的42％。在我国是终末期肾病的第三位原因，占血液透析患者的13.5％，腹膜透析患者的12％。在所有糖尿病患者中，2型糖尿病约占97％，2型糖尿病的核心问题是胰岛素抵抗和随后出现的高血糖，高血糖可通过晚期糖基化产物形成、促进多种生长因子表达、启动氧化应激等多种机制引起糖尿病患者肾脏血流动力学异常和细胞外基质积聚，导致肾小球硬化和蛋白尿的产生。胰岛素抵抗是由胰岛素受体和受体后缺陷导致胰岛素信号下传障碍所致，对胰岛素信号传导通路的研究表明：雷帕霉素靶分子（mammalian target of rapamycin，mTOR）位于胰岛素的下游，接受营养信号、能量信号和生长因子信号而调节细胞增殖和生存，并可通过其效应分子反馈性抑制胰岛素信号的下传，引起胰岛素抵抗；mTOR还参与血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达调控，而VEGF在糖尿病肾病发病过程中起重要恶化作用。本研究主要探讨mTOR特异性抑制剂雷帕霉素治疗2型糖尿病和糖尿病肾病的疗效及机制。目的探讨mTOR特异性抑制剂雷帕霉素治疗2型糖尿病及其肾脏损害的疗效和机制；探讨胰岛素诱导人系膜细胞（human mesangial cells，HMCs）VEGF转录激活的机制及雷帕霉素抑制VEGF表达的机制。材料、方法选择2型糖尿病模型KKAy小鼠，分别应用雷帕霉素、长效人胰岛素和安慰剂治疗，探讨雷帕霉素对KKAy小鼠血糖、胰岛素抵抗及糖尿病肾脏损害指标的影响，包括：肾重（kidney weight，KW）、尿白蛋白／肌酐(urine albumin／urine creatinine，UALB/Cr)、肾小球体积（glomerular volume，GV）和肾小球基底膜（glomerularbasement membrane，GBM）厚度。应用Real-time PCR、Westernblot和免疫组化检测KKAy小鼠肾组织VEGF、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）表达，了解雷帕霉素对VEGF、CTGF和FN表达的影响。应用荧光素酶分析、Real-time PCR、Westernblot方法探讨胰岛素调节人肾小球系膜细胞HMC VEGF转录激活的机制，澄清胰岛素是否通过PI3K／mTOR通路上调低氧诱导因子-1a（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1a）表达而引起VEGF转录增加。结果1．16周龄KKAy小鼠表现为肥胖、高血糖和高甘油三酯血症。治疗4周后：雷帕霉素治疗组小鼠体重明显低于对照组和胰岛素治疗组，p＜0.05。雷帕霉素治疗组血糖17.2±7.3mmol／L，低于对照组29.1±3.2mmol／L，p＜0.05。治疗8周：雷帕霉素治疗组体重显著低于对照组（32.2±3.1 vs 39.3±2.8g，p＜0.05），血糖低于对照组但没达统计学差异（18.2±3.7 vs 24.4±5.1 mmol／L，p=0.06）。2．胰岛素敏感试验表明：雷帕霉素治疗组注射常规胰岛素后，血糖迅速降低，最大降糖作用发生于60min，为4.88±0.73mmol／L，明显大于对照组（2.65±2.12mmol／L，p＜0.05）。3．16周龄KKAy小鼠与同周龄C57BL小鼠比较表现为KW增加、UALB／Cr升高和GV增大。治疗后，雷帕霉素治疗组KW、UAlb／Cr、GV明显低于对照组，差异有统计学意义，其中GV在治疗4w和8w时均低于胰岛素治疗组，p＜0.05和p＜0.01。4．治疗8w后，对照组GBM明显增厚，显著高于雷帕霉素治疗组（284.41±83.73vs 144.58±12.70nm）和胰岛素治疗组（185.82±18.24nm），p＜0.001和p＜0.01；雷帕霉素治疗组GBM厚度略小于胰岛素治疗组，但差异无统计学意义。5．免疫组化结果显示：在KKAy小鼠和C57BL小鼠，VEGF主要表达在远端肾小管、小血管内皮细胞，近端肾小管上皮细胞表达较少。正常小鼠肾小球几乎看不到VEGF表达，KKAy小鼠肾小球VEGF表达增加，雷帕霉素治疗组肾小球VEGF阳性面积低于对照组和胰岛素治疗组，差异有统计学意义。Real-time PCR结果显示：16w KKAy小鼠肾组织VEGF、FN mRNA表达明显高于同周龄C57BL小鼠，p＜0.05。治疗4w和8w后，雷帕霉素治疗组VEGF、FN mRNA表达量明显低于对照组和胰岛素治疗组，差异有统计学意义。Westernblot结果显示：16w KKAy小鼠肾组织VEGF188、VEGF164、CTGF蛋白表达均高于同周龄C57BL小鼠。4w和8w后，雷帕霉素治疗组肾脏VEGF188、VEGF164蛋白表达明显低于对照组，p＜0.01。治疗4w时，雷帕霉素治疗组肾脏VEGF164表达和治疗8w时VEGF188、VEGF164表达均低于胰岛素治疗组，p＜0.01。治疗8w时，胰岛素治疗组VEGF188、VEGF164表达低于对照组，p＜0.05和p＜0.01。雷帕霉素和胰岛素治疗对KKAy小鼠肾脏CTGF表达无影响。6．胰岛素剂量依赖性增加HMC VEGF转录，在100nM时达高峰，为未刺激组2.14±0.17倍，p＜0.001。胰岛素诱导HMC VEGF转录依赖PI3K／mTOR通路和HIF-1表达。VEGF转录依赖mTOR的丝氨酸／苏氨酸激酶活性。胰岛素刺激虽可使转染mTOR-WT、mTOR-RR的HMC VEGF转录增加，但效应明显弱于转染对照质粒，分别为胰岛素未刺激组1.29、1.23和1.93倍。雷帕霉素可抑制转染mTOR-WT质粒的HMC VEGF转录。7．胰岛素或转染具有激酶活性的mTOR质粒可促进HMC HIF-1α蛋白的表达，但对HIF-1αmRNA表达无影响。雷帕霉素可抑制胰岛素诱导及转染mTOR-WT质粒的HMC HIF-1α蛋白表达。结论在本实验条件下：1．雷帕霉素可降低2型糖尿病小鼠体重、血糖，改善胰岛素抵抗；2．雷帕霉素可减轻2型糖尿病小鼠早期肾脏损害，降低KW、UALB／Cr、GV；3．雷帕霉素可延缓2型糖尿病小鼠GBM增厚；4．雷帕霉素可抑制2型糖尿病小鼠肾脏VEGF mRNA和蛋白表达，而对CTGF表达无影响；5．胰岛素可促进HMC VEGF基因转录，该作用是通过激活PI3K／mTOR通路，然后再通过转录后机制促进HIF-1α蛋白表达实现的。