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研究背景:慢性髓系白血病(CML)是一种起源于造血干细胞的髓系增殖性肿瘤,以表达具有持续酪氨酸激酶活性的Bcr-Abl融合基因为特征。伊马替尼(IM)作为第一代酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的出现,明显改善了大部分CML患者的预后,但仍有部分患者对TKI耐药,从而导致疾病的进展。因此,迫切需要寻找新的治疗策略来克服CML耐药。具有选择性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)已成为抗肿瘤药物研究的新热点,可用于多种恶性血液病及实体瘤。西达本胺作为苯酰胺类HDACi,可通过表观遗传调控机制,在恢复耐药肿瘤细胞对药物的敏感性和抑制肿瘤转移、复发等方面发挥潜在作用。目前西达本胺首个临床适应症为复发及难治性外周T细胞淋巴瘤,也有报道西达本胺能有效杀伤急性白血病细胞,但在CML中的研究尚未见报道。研究目的:本研究旨在探讨西达本胺联合伊马替尼对慢性髓系白血病耐药细胞的杀伤作用,并进一步揭示联合用药克服白血病耐药的分子机制,为治疗慢性髓系白血病TKI耐药患者提供新策略。研究方法:以人CML细胞株KBM5和KBM5-T315I作为研究对象,二者均携带Bcr-Abl融合基因,前者对TKI敏感,后者因伴有T315突变而对TKI耐药。1.西达本胺对CML细胞生物学行为的影响:CCK-8法检测西达本胺对CML细胞活性的影响;流式细胞术分析西达本胺对CML细胞周期及凋亡的影响。2.西达本胺联合伊马替尼对CML细胞的作用分析:使用低浓度西达本胺单药或联合IM作用CML细胞48h后,CCK-8法检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡,集落形成实验观察细胞克隆情况,并用CalcuSyn软件进行联合作用分析。3.β-catenin在CML原代细胞和细胞株中的表达分析:免疫印迹试验(Western-blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测TKI敏感与耐药原代细胞和细胞株中β-catenin蛋白及mRNA水平的表达差异。4.西达本胺联合IM对CML细胞中β-catenin信号通路、Bcr-Abl活性及HDAC活性的影响:Western-blot检测单药或联合用药后β-catenin及其下游靶基因C-myc和Surivin的蛋白表达变化,并分析Bcr-Ab1、Stat5和Crkl蛋白的磷酸化水平,及细胞组蛋白H3乙酰化水平和Caspase-3/-8/-9凋亡通路相关蛋白的变化。研究结果:1.西达本胺能抑制KBM5和KBM5-T315I细胞活性,具有诱导细胞凋亡及周期阻滞(G0/G1期停滞)的作用。48h时IC50分别为4.5uM,8.4uM(P=0.001)。2.与单药西达本胺或IM组相比,低浓度的西达本胺(1～4uM)联合IM能明显抑制KBM5和KBM5-T315I细胞增殖并诱导其凋亡,联合指数CI均小于1(ED50处CI值分别为0.16和0.02,P<0.05),提示二者联用具有协同抗CML作用,并且在耐药细胞株中的协同作用更强。3.β-catenin在TKI耐药的CML原代细胞和细胞株中均高表达,并且与Bcr-Abl的表达量无明显相关性,提示TKI耐药细胞中可能存在β-catenin信号通路的活化,并且与非Bcr-Ab1依赖的TKI耐药有关。4.与单药组相比,联合用药组能明显下调TKI耐药株中β-catenin、C-myc和Surivin蛋白表达,抑制Bcr-Ab1、Stat5和Crk1蛋白磷酸化,上调组蛋白H3乙酰化水平,并能明显激活Caspase-9和Caspase-3的表达。结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺可通过诱导CML细胞G0/G1期阻滞、抑制细胞增殖并诱导其凋亡,发挥抗CML作用;使用低浓度西达本胺联合伊马替尼对TKI耐药细胞有明显的协同抑制和杀伤作用;联合用药不仅能靶向抑制Bcr-Ab1活性及增强组蛋白乙酰化水平,还能明显下调TKI耐药细胞中异常激活的β-catenin信号通路,克服IM耐药,并通过激活Caspase-9内源性凋亡途径,从而诱导CML耐药细胞凋亡。