1.背景及目的:在我国,无论相对发病率还是绝对病例数,肝纤维化患者均居世界首位,其主要病因为:病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病或药物性肝病等,肝纤维化不仅是肝脏损伤的病理修复反应,还会进一步发展为肝硬化、肝癌、肝衰竭^[1],是严重危害人民健康和消耗社会资源的难治性疾病。因此,抗肝纤维化是慢性肝病的重要治疗环节。西医学已有较多的临床试验报道,对于慢性病毒性（乙型、丙型）肝炎抗病毒治疗可有效逆转肝纤维化^[2],但迄今临床上仍缺乏直接针对纤维结缔组织增生的有效治疗肝纤维化的生物或化学药物,而中药及其复方具有多组分、多途径与多环节的综合作用特点,近年来发现在抗肝纤维化治疗方面有明显优势,已经取得了较好的临床疗效,如扶正化瘀胶囊（片）、复方鳖甲软肝片等^[3-5]。虫草菌丝作为中医药抗肝纤维化药物扶正化瘀胶囊/片中最重要的扶正药物,课题组前期大量研究证实以虫草菌丝为主药的扶正药物在促进肝纤维化逆转中发挥主要作用,为了解析其发挥抗肝纤维化作用的主要活性成分,课题组前期开展系列活性导向研究,并在近两年取得了可喜的进展,成功从虫草菌丝主要活性部位中分离并证实了一种脂溶性成分C02是虫草菌丝抗肝纤维化主要活性成分,课题组目前已经申请国家发明专利,但由于C02成分抗肝纤维化的作用机制仍不明确,制约了其进一步的新药开发与应用。因此本研究拟开展C02体内外抗肝纤维化研究,试图解析其抗肝纤维化机制,为其新药开发与应用提供参考。2.方法:（1）C02体内抗肝纤维化作用与机制研究:建立CCl4小鼠肝纤维化模型及DMN大鼠肝纤维化模型,给予C02干预治疗后,收集血清及肝组织。通过肝组织HE及天狼猩红胶原染色、羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量、血清肝功能指标、纤维化相关指标因子的免疫组化及蛋白、基因水平变化等检测,探讨虫草菌丝活性成分C02潜在抗纤维化的作用机制。（2）C02对肝星状细胞（HSCs）与巨噬细胞活化、增殖的影响:体外采用不同浓度的C02对激活的JS-1（小鼠肝星状细胞）进行干预,观察HSCs活化、增殖相关基因及蛋白的变化;采用不同浓度的C02对LPS激活的巨噬细胞（RAW264.7小鼠巨噬细胞）进行干预,检测巨噬细胞活化、增殖相关指标基因及蛋白的变化。（3）C02通过调控巨噬细胞表型抑制HSCs活化的研究:体外采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活化模型,给予C02及STAT1抑制剂干预24 h,去药后与正常JS-1细胞共培养24 h,分别收取RAW264.7巨噬细胞及JS-1细胞,检测巨噬细胞及肝星状细胞活化、增殖相关指标基因及蛋白的变化。观察活化的巨噬细胞对肝星状细胞活化的影响以及C02的干预作用;3.结果:（1）C02对CCl4诱导肝纤维化小鼠的干预作用:C02对CCl4诱导的纤维化小鼠肝功能有明显的改善作用,C02中、高剂量组可有效降低血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）含量,且高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）;小鼠肝组织天狼猩红染色、胶原半定量及肝组织HE染色结果显示,C02高剂量组可有效减少胶原沉积及肝脏炎性细胞浸润,肝组织羟脯氨酸结果与胶原半定量结果基本一致（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02用药组α-SMA、COL-I表达较模型组显著减少,且C02高剂量组药效优于低剂量组,荧光定量RT-PCR和Western-blot结果表达与免疫组化结果基本一致（P<0.01或P<0.05）。Western-blot蛋白免疫印迹结果显示,C02高剂量组p-ERK/ERK、PDGF、TNF-α蛋白水平较模型组显著下降（P<0.05）;较模型组相比,C02高剂量组M1型巨噬细胞表型相关蛋白STAT1及IRF5表达下调（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02高剂量组小鼠M1型巨噬细胞标记物CD11b阳性表达较模型组明显减少,M2型巨噬细胞标记物CD206阳性表达较模型组有所增加。（2）C02对DMN诱导肝纤维化大鼠的干预作用:C02对DMN诱导的纤维化大鼠肝功能有改善作用,C02中、高剂量组可有效降低AST、ALT含量,且高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）;大鼠天狼猩红染色、胶原半定量及肝组织HE染色结果显示,C02高剂量组可有效减少胶原沉积及肝脏炎性细胞浸润,肝组织羟脯氨酸结果与胶原半定量结果基本一致（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02用药组α-SMA、COL-I表达较模型组显著减少,且C02高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）,荧光定量PCR及Western-blot结果与免疫组化的结果表达基本一致。Western-blot结果显示,C02高剂量组p-ERK/ERK、PDGF、TNF-α蛋白水平较模型组显著下降（P<0.05）;较模型组相比,C02高剂量组M1型巨噬细胞表型相关蛋白STAT1及IRF5表达下调（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02高剂量组大鼠M1型巨噬细胞标记物CD68阳性表达较模型组明显减少,M2型巨噬细胞标记物CD163阳性表达较模型组有所增加。（3）C02对肝星状细胞（HSCs）及巨噬细胞活化、增殖的影响:C02能够呈剂量依赖性的抑制小鼠肝星状细胞（JS-1）及原代肝星状细胞的增殖（P<0.05）;JS-1细胞经5 ng/m L TGF-β1处理激活造模,采取不同浓度C02干预,较模型组相比,40μM C02可显著降低JS-1细胞α-SMA和COL-I基因及蛋白的水平（P<0.05）;F-actin细胞染色结果显示,C02在20μM、40μM浓度时可成不同程度降低JS-1细胞F-actin的表达;原代小鼠肝星状细胞的油红染色实验结果显示,C02可显著增加原代肝星状细胞胞质内脂滴含量。RAW264.7巨噬细胞经100 ng/m L LPS处理激活造模,采取不同浓度C02干预,荧光定量PCR结果显示,较模型做相比,C02在10μM浓度时TGF-β1、IL-1、PDGF等相关炎性因子较模型组m RNA表达下降（P<0.01或P<0.05）;Elisa结果显示,5μM和10μM C02可在2 h-36 h内持续降低巨噬细胞分泌PDGF-BB的含量（P<0.05）,2.5μM、5μM和10μM C02可在8 h-36 h内持续降低巨噬细胞i NOS分泌量（P<0.05）;C02对巨噬细胞的起效浓度较对HSCs的起效浓度低2-16倍。（4）C02通过调控巨噬细胞表型抑制HSCs活化的研究:RAW264.7巨噬细胞与JS-1细胞共培养:LPS激活的RAW264.7巨噬细胞给予C02及STAT1抑制剂干预24h,去药后与JS-1细胞共培养24 h,模型组JS-1细胞α-SMA m RNA表达水平明显升高（P<0.05）,C02干预后,高剂量组α-SMA m RNA表达下调（P<0.05）,细胞爬片免疫荧光α-SMA检测也得到同样的结果;Western-blot蛋白免疫印迹结果显示,C02高剂量组可抑制JS-1细胞p-ERK/ERK的蛋白表达（P<0.01或P<0.05）。STAT1抑制剂组可抑制JS-1细胞α-SMA、COL-I m RNA的表达水平,STAT1抑制剂联合C02高剂量组药效优于STAT1或C02高剂量组单用组（P<0.05）;STAT1抑制剂及C02可抑制M1型巨噬细胞标志物CD11b及PDGF m RNA表达水平,且STAT1抑制剂联合C02高剂量组药效优于STAT1或C02高剂量组单用组（P<0.05）。4.结论:（1）体内药效学研究表明C02可有效改善CCl4小鼠肝纤维化模型及DMN大鼠肝纤维化模型的肝功能及纤维化程度,C02可以抑制M1型巨噬细胞及HSCs活化,同时发现C02在体内的作用机制与PDGF/ERK信号通路有关。（2）体外实验研究表明C02可能通过抑制STAT1进而抑制M1型巨噬细胞活化,从而减少PDGF-BB、TNF-α等因子释放,进而抑制HSCs的活化,其抑制HSCs活化的作用机制与PDGF/ERK信号通路有关。