骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）好发于儿童和青少年，是临床上最常见的原发性恶性骨肿瘤之一。其恶性程度高、血行转移发生早、肺转移发生率高、患者病情发展快且死亡率十分高。准确地对骨肉瘤做出早期诊断和有效地抑制或阻断骨肉瘤转移，已经成为骨肉瘤治疗领域的研究重点。深入认识骨肉瘤转移的分子机制对其基因靶向治疗具有十分重要的指导作用。因此，科研工作者致力于寻找更为重要的骨肉瘤转移的相关分子并试图阐明其分子机制。miRNA (microRNA)是一类进化上高度保守的、非编码蛋白质的小分子RNA。它在多种生物体中广泛表达。通过对靶基因的转录后调控，miRNA参与多种肿瘤转移的调控。前期研究表明，miR-195能够显著抑制骨肉瘤细胞的转移能力，但是其具体的作用机制仍不十分清楚。Wnt信号通路是目前肿瘤研究领域的热点之一。Wnt信号通路参与调控包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的发生、发展、转移等病理过程。课题组前期基因芯片检测结果显示，Wnt信号通路分子成员NKD1在高转移能力骨肉瘤细胞系F5M2中高表达，提示NKD1可能促进骨肉瘤的转移。同时，生物信息学分析结果显示NKD1是miR-195的潜在靶基因。这为进一步研究miR-195的作用机制奠定了良好的实验基础。结合上述―miR-195能够显著抑制骨肉瘤转移‖的研究基础，课题组提出了NKD1调控骨肉瘤转移机制的推论，即：NKD1参与介导miR-195对骨肉瘤转移的抑制作用。基于以上推论，研究NKD1在骨肉瘤转移中的作用和阐明其调控骨肉瘤转移的分子机制具有十分重要的临床指导意义。研究目的：本实验拟通过研究：阐明NKD1在骨肉瘤组织中的表达及其与骨肉瘤分级分期、病理类型、预后、患者生存率等临床表型之间的相关性；阐明NKD1在骨肉瘤转移中的调控作用及其分子机制；证明NKD1是miR-195的直接靶基因，并参与介导miR-195对骨肉瘤转移的调控。以期最终阐明NKD1在miR-195调控骨肉瘤转移中的作用及机制，为其在骨肉瘤转移的基因靶向治疗、早期诊断以及预后判断等方面的临床应用提供新的研究思路和切入点。研究方法：1.分别采用Realtime RT-PCR分析及Western Blot分析的方法，检测NKD1在不同转移能力骨肉瘤细胞系（F4和F5M2）中的表达情况，以验证NKD1在以上细胞中的差异表达。2.构建NKD1的干涉质粒pSil-NKD1-sh，将其转染入骨肉瘤细胞F5M2，并用G418筛选出稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh，为进一步研究NKD1在骨肉瘤转移中的作用及机制奠定实验基础。3.利用稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh，进行NKD1的功能缺失实验。在细胞水平，检测骨肉瘤细胞F5M2+NKD1-sh增殖、迁移及侵袭能力的变化情况；在裸鼠模型中，检测骨肉瘤细胞F5M2+NKD1-sh原位成瘤能力和肺转移能力的变化情况。4.首先，对NKD1和miR-195之间的调控关系进行生物信息学分析。然后，分别采用Realtime RT-PCR及Western Blot技术检测在骨肉瘤细胞中改变miR-195水平后NKD1的表达情况。最后，采用双荧光素酶报告基因系统证明NKD1mRNA3’UTR和miR-195之间直接结合，NKD1是miR-195的直接靶基因。5.收集福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）的骨肉瘤组织标本，用免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）的方法检测NKD1蛋白的表达水平，并统计分析其与骨肉瘤转移、分级分期、病理类型、患者预后及生存率等临床表型之间的相关性。研究结果：1.分别采用Western Blot分析和Realtime RT-PCR分析的方法，检测骨肉瘤细胞系F4和F5M2中NKD1的表达情况，结果显示：NKD1在F5M2中的表达较F4中明显降低，与基因芯片检测结果一致。2.成功构建了NKD1的干涉质粒pSil-NKD1-sh，并筛选出稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh及其对照骨肉瘤细胞系F5M2+NC。Real-timeRT-PCR及Western Blot检测显示：NKD1在F5M2+NKD1-sh细胞中的表达较对照组明显降低。3.在体外细胞水平，质粒pSil-NKD1-sh对骨肉瘤细胞F5M2的侵袭和迁移能力有明显的抑制作用，而对增殖能力无显著影响。在裸鼠体内，质粒PSil-NKD1-sh对骨肉瘤细胞的肺转移能力和原位成瘤能力均有显著的抑制作用。4.生物信息学分析结果显示：NKD1是miR-195的潜在直接靶基因。在骨肉瘤细胞中，上调（下调）miR-195水平可以抑制（促进）NKD1的表达。双荧光素酶报告基因系统证明NKD1mRNA3’UTR和miR-195之间直接结合。5.骨肉瘤组织中NKD1蛋白表达阳性率明显高于骨样骨瘤组织和骨软骨瘤组织；而骨样骨瘤组织NKD1蛋白表达阳性率与骨软骨瘤NKD1蛋白表达阳性率相比无显著差异。同时，NKD1的表达与骨肉瘤是否转移及患者3年生存率显著相关，而与性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级、组织学分型及肿瘤发生部位等临床表型无明确相关性。研究结论：1. NKD1的表达水平与骨肉瘤细胞的转移能力呈正相关性，这提示NKD1可能促进骨肉瘤的转移。因此，有必要进一步深入研究NKD1在骨肉瘤细胞转移中的功能及其分子机制。2.稳定下调NKD1表达水平的骨肉瘤细胞系F5M2+NKD1-sh及其对照骨肉瘤细胞系F5M2+NC构建成功。这为进一步研究NKD1在骨肉瘤细胞中的功能及其分子机制奠定了实验基础。3.在体外细胞水平及裸鼠体内，pSil-NKD1-sh均可以显著抑制骨肉瘤细胞的转移能力。提示，NKD1有可能成为骨肉瘤转移基因靶向治疗的新靶点。4.证明了NKD1是miR-195的直接靶基因。结合NKD1促进骨肉瘤转移以及miR-195抑制骨肉瘤转移的前期研究结果，NKD1可能介导miR-195对骨肉瘤转移的抑制。这为NKD1在骨肉瘤基因靶向治疗中的临床应用提供了一定的理论依据和实验基础。5. NKD1在骨肉瘤组织中的表达与是否转移及患者3年生存率显著相关。这提示，NKD1在骨肉瘤的转移过程中发挥着重要作用，有可能作为新的反映骨肉瘤转移及预后的重要分子标志物。