丹参酮IIA(tanshinone IIA，TS IIA)是中药丹参根中的脂溶性有效成分，大量药效学研究及临床观察表明具有多种药理作用，如心血管作用、抗肿瘤作用、抗肝纤维化作用、抗白血病作用、抗菌作用等。相对其大量丰富的药效学研究数据，目前对TS ⅡA药代动力学的特征并不十分了解，因此深入研究TS IIA的药代动力学行为特征和相关机制，对全面了解其吸收特性、分布、代谢、排泄特点，指导TS ⅡA的新药研究开发具有重要意义。 本研究的主要目的是系统地研究TS ⅡA在大鼠体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，同时利用各种整体、在体、体外实验模型阐明TS ⅡA在小肠的吸收特性、肝/肠首过效应对吸收过程的影响、TS ⅡA及其结合型是否存在肝肠循环，为TS ⅡA的新药开发、为其它丹参酮类化合物的药代动力学研究提供理论依据。同时，通过研究参与TS ⅡA代谢所涉及的代谢酶以及TS ⅡA对细胞色素P450酶主要亚型的活性影响，为预测潜在的代谢性相互作用，为临床合理用药提供参考。 一、大鼠生物样品中TS ⅡA分析方法的建立 建立并验证生物样品中TS ⅡA的灵敏、特异、可靠、线性范围广的检测方法。采用乙醚液．液萃取提取生物样品中的TS ⅡA和内标氯雷他定，采用液相色谱．串联质谱方法检测。离子源为电喷雾离子化源(ESI)；检测方式为正离子检测；扫描方式采用选择反应监测(SRM)，用于定量分析的离子反应分别为m/z 295→249(TS IIA)和m/z 383→266(氯雷他定)。色谱分析柱为Hypersil BDS C<,18>柱(2.1 mm×50 mm，5lμm)；流动相为甲醇-水(90：10，v/v)(水中含1﹪甲酸)；流速为300 μL/min；每个样品的分析时间为2 min。分析方法的定量下限为1.0ng/mL，各生物样品中TS IIA的线性相关程度良好(r<2>均大于0.99)。以质控样品计算该分析方法的批内精密度RSD在1.3﹪～13.6﹪范围内，批间精密度RSD在1.0﹪～10.9﹪范围内；方法的准确度在90.5﹪～112.1﹪之间；方法的提取回收率在血浆中为60.2﹪～67.3﹪，在肝匀浆中为68.6﹪～71.4﹪，在尿、胆汁、粪匀浆中为50.7﹪～67.5﹪，在HBSS、肠灌流液、肝微粒体体系中为37.3﹪～49.6﹪。该分析方法经验证结果满意，样品处理及检测过程较已报道的方法简单、快速，可满足TS ⅡA临床前药代动力学研究的要求。 二、Ts ⅡA在大鼠体内的药代动力学及生物利用度研究 研究单次口服或静脉注射给予6.7、 20、60 mg/kg三个剂量的TS IIA后原型及结合型TS IIA在大鼠体内的药代动力学及生物利用度。采用高效液相色谱．串联质谱(LC/MS/MS)方法测定血浆中TS ⅡA的浓度，用非房室模型计算其药代动力学参数。结果显示，大鼠静脉注射给予相当于TS ⅡA 6.7、20、60 mg/kg三个剂量的TS ⅡA包合物后，低剂量大部分时间点、中剂点少部分时间点检测不到原型TS ⅡA；给药约15～30 min后以结合型TS ⅡA占主导地位；静脉给药后原型和结合型TS IIA在大鼠体内基本符合非线性药代动力学。大鼠口服6.7、20、60 mg/kg三个剂量的TS ⅡA纯品后，在体循环内原型药物仅以低水平存在，而以结合型TS ⅡA为主；TS ⅡA口服后的生物利用度非常低，以原型计只有(5.0±1.6)﹪；口服后原型和结合型TS ⅡA在大鼠体内符合线性药代动力学；其血浆药物浓度一时间曲线呈现多峰现象。胃肠吸收不齐性可能会造成出现多峰现象；而组织再分布或肝肠循环是否造成多峰现象的原因，需要进行组织分布实验和通过考察肝肠循环现象来确证。对口服后TS ⅡA低生物利用度的原因，有必要通过研究TS ⅡA的肠吸收机制及肝/肠首过效应等现象来作进一步分析。 三、Ts ⅡA吸收特性、首过效应研究及影响生物利用度的因素分析 通过在体肠灌流模型、体外Caco-2细胞模型考察了TS ⅡA的吸收特性和代谢；通过体外肝微粒体转化技术、离体肝脏灌流模型、腹腔注射给药等方法考察了肝脏对TS ⅡA的首过效应。从TS ⅡA的理化物质、剂型、胃肠道稳定性分析了其它影响TS ⅡA口服生物利用度的因素。Caco-2细胞模型及肠灌流的实验结果表明，TS ⅡA的小肠膜通透性非常差，造成极低的小肠吸收；灌流小肠的血循环中只检测到结合型TS ⅡA的存在，说明小肠是形成葡萄糖醛酸结合型TS ⅡA的另一个代谢场所。大鼠肝微粒体转化实验、离体肝灌流实验、腹腔注射给药的实验结果表明，TS ⅡA在肝脏有显著的首过效应，能被肝脏迅速代谢、滞留、排泄，肝脏对TS ⅡA有较高提取率。综合TS ⅡA的理化性质、剂型、胃肠道稳定性等分析，造成TS IIA口服生物利用度极低的原因主要有：(1)TS IIA的小肠膜通透性非常差，小肠吸收少，导致极低的生物利用度；(2)TS ⅡA在大鼠小肠有首过代谢，在肝脏也有明显的首过效应，这也导致生物利用度降低；(3)TS ⅡA本身的理化物质，如水溶性低和强亲脂性也对其低生物利用度造成影响；(4)TS ⅡA在胃肠道的稳定性以及剂型差异对TS ⅡA的生物利用度影响不大。 四、Ts ⅡA在大鼠体内的分布研究 研究口服和静脉注射给药后原型TS ⅡA在大鼠各组织中的分布特点及组织中药物浓度随时间的变化规律。大鼠单次口服或静脉注射给予TS ⅡA 60 mg/kg后于0．5、4、10、24、48、72、96、144 h(192、288 h)处死动物，取各组织器官，制成0.5 g/mL匀浆，取匀浆处理，采用高效液相色谱．串联质谱(LC/MS/MS)方法测定各组织匀浆中TS ⅡA的浓度。结果显示，TS ⅡA给药后在体内能迅速、广泛分布于各组织器官，并且绝大部分组织的药物浓度远高于血浆药物浓度。口服给药时以胃肠道最高，其次是肺部和肝脏，静注给药时以肺部和肝脏最高；在脑组织以及睾丸中药物浓度非常低，说明Ts ⅡA不易透过血一脑屏障和血一睾屏障进入脑组织和睾丸。肾脏的药物浓度不高，这与尿排泄结果吻合。给药后第4天仍在较多的组织中检测到TS ⅡA，在静注给药后第12天在肺部仍检测到TSⅡA，说明药物在组织消除较慢，而且在局部组织有较大量蓄积和较长的滞留。TS ⅡA高度脂溶性可能是造成TS ⅡA肺部蓄积以及广泛高浓度组织分布的原因之一。TS ⅡA在组织的高浓度与血药浓度的极低现象提示组织再动员再分布的可能性，组织中高浓度的药物很可能会重新释放入血，形成药物在体内的再分布，从而造成TS ⅡA药时曲线的多峰现象。 五、TS ⅡA在大鼠体内的排泄及肝肠循环的研究 大鼠单次口服或静脉注射给予TS ⅡA 60 mg/kg后收集尿液、胆汁和粪便样品，采用高效液相色谱．串联质谱(LC/MS/MS)方法测定样品中原型和总TS ⅡA的浓度，计算药物累积排泄量和累积排泄百分率。通过胆汁引流组与非胆汁引流组的数据比较、Linked-rat模型、十二指肠给予胆汁排泄物的重吸收实验来考察药物的肝肠循环。结果显示，TS ⅡA静脉给药后原型药物和总TS ⅡA经尿排泄累积百分率为0.01﹪、0.03﹪，经胆汁排泄为3.5﹪、12.7﹪，经粪排泄为15.25﹪、16.5﹪，经尿、粪、胆汁排泄的累积百分率原型药物为18.7﹪，总TS ⅡA为29.2﹪，有限的原型药物排泄提示大部分药物在体内可能广泛代谢为其它产物。TS ⅡA口服给药后原型药物和总TS ⅡA经尿排泄累积百分率为0.0026﹪、0.0031﹪，经胆汁排泄为2.4﹪、4.6﹪，经粪排泄为62.0﹪、72.6﹪，经尿、粪、胆汁排泄的累积百分率原型药物为64.4﹪，总TS ⅡA为77.2﹪。可见，药物自尿的排泄非常有限，而粪和胆汁是TS ⅡA的主要排泄途径。胆汁引流组与非胆汁引流组的比较、Linked-rat模型实验、十二指肠给予胆汁的重吸收实验结果表明，原型TS ⅡA和结合型TS ⅡA均可形成肝肠循环；结合型TS ⅡA的肝肠循环对其药代动力学行为有显著影响，而原型TS ⅡA的肝肠循环未对其药代动力学造成影响。 六、Ts ⅡA在大鼠肝微粒体的代谢及对CYP酶亚型的体外抑制作用 研究TS IIA在大鼠肝微粒体酶中的代谢，选择性细胞色素(CYP)酶抑制剂对TS ⅡA代谢的影响，以及TS ⅡA对大鼠6种主要CYP450酶亚型活性的影响。结果显示，TS ⅡA在大鼠肝微粒体酶中的最大反应速率(V<,max>)为(1.20±0.18)nmol/min/mg protein；米氏常数(K<,m>)为(4.35±0.67)nmol/mL；对药物的清除率CL<,int>为(0.28±0.06)mL/min/mg protein。噻氯匹啶和酮康唑能够显著抑制TS ⅡA的代谢，奎尼丁对TS ⅡA的代谢也有一定的抑制作用，而其他CYP酶抑制剂对TS ⅡA的代谢无明显影响。由以上结果来看，C’YP2C19和CYP3A1主要参与了TS ⅡA的代谢，CYP2D6也起到了部分代谢作用；这些CYP酶的抑制剂可能使TS ⅡA的代谢受到抑制，造成药物药效或毒性的增加。 七、Ts ⅡA在大鼠体内外代谢物的初步研究 采用：HPLC、LC/MS/MS技术，用体内代谢的方法通过对给药后大鼠的胆汁、血浆、尿液和粪便样品分析，对TS ⅡA在体内的代谢产物、代谢途径及主要代谢部位进行了研究。