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目的对一个遗传性无纤维蛋白原血症的先证者及其家系进行基因分析,筛选致病基因突变,并探讨该家系发病的可能分子机制。方法1常规实验室方法检测先证者及其胞弟、父母凝血功能中活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT),通过免疫比浊法及凝固法(cluss法)分别检测纤维蛋白原抗原及其活性。2免疫印迹实验(Western-blot)检测家系成员及正常对照者外周血血浆纤维蛋白原α链、β链及γ链3条肽链的表达。3提取家系成员及健康对照者外周血基因组DNA,普通PCR扩增编码纤维蛋白原3条肽链的3个基因FGA、FGB、FGG的所有外显子、外显子与内含子交界处、启动子区序列,通过一代测序寻找可能的致病基因突变。通过二代测序技术对先证者及其母亲进行全基因组测序,筛选与引起疾病有关的基因突变。筛选的基因突变与NCBI基因数据库比较排除基因多态性。4将发现的可能致病基因突变拷贝入神经元网络剪接位点预测软件预测基因突变可能引起的剪接位点改变。分别以先证者及对照者外周血DNA为模板,设计引物扩增包含突变位置的突变序列及正常序列,分别克隆至哺乳动物载体pc DNA3.1(-),构建含有突变序列的FGG小基因质粒(Wt-FGG)及含有正常序列的FGG小基因质粒(NtFGG),并将2种质粒分别转染COS-7细胞,提取细胞总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)法逆转录成c DNA。经琼脂糖凝胶电泳初步验证目的片段,并进行一代测序,将测序结果与NCBI中正常m RNA序列比对。利用DNASIS软件分析基因突变后可能引起的氨基酸改变。结果1先证者及胞弟APTT>200s、PT及TT>100s,父母的检测值均正常。免疫比浊法及Cluss法检测先证者及胞弟纤维蛋白原含量均为0,父母的检测值均略低于正常值下限。2 Western-blot法检测先证者及胞弟外周血无纤维蛋白原肽链表达,父母与正常对照者分别在65KD、52KD、46KD显示3条带,为α链、β链及γ链,但父母纤维蛋白原肽链表达低于对照者。3一代测序未在外显子与内含子交界处及启动子区发现基因突变,外显子区仅在FGA的5号外显子第4266位核苷酸检测到基因突变,先证者及胞弟核苷酸g4266 A纯合突变为G,使第331位苏氨酸错义突变为丙氨酸(P 331 Thr>Ala),父母为相同位置的杂合突变,该突变是已经报道的基因多态性位点。对先证者及其母亲二代全基因组测序后,经过筛选,先证者FGG 3号内含子第5个核苷酸G纯合突变为A,FGG IVS3+5G>A,母亲为相同突变位置的杂合子,通过一代测序验证其他家系成员相同位置,胞弟与先证者为相同的纯合突变,父亲与母亲为相同位置的杂合突变,检测30名正常健康对照者未发现相同的基因突变,查询NCBI中SNP基因数据库排除基因位点多态性。4剪接位点预测软件结果示突变后序列供体剪接位点消失,未激活隐蔽剪接位点及产生新的剪接位点。以先证者及健康对照者外周血DNA为模板扩增的片段长766bp,Wt-FGG逆转录后的c DNA经琼脂糖凝胶电泳目的条带约280bp,Nt-FGG的c DNA约为460bp,一代测序验证结果显示Wt-FGG m RNA与Nt-FGG m RNA相比缺少3号外显子,共184个碱基。与NCBI中FGG m RNA氨基酸序列比对,突变后形成的异常m RNA缺少3号外显子所编码的第16至76个氨基酸。DNASIS软件显示在4号外显子的第2个氨基酸形成终止密码子,预测体外构建的细胞模型转录后形成只含16个氨基酸的截短γ链。结论1 FGG基因3号内含子的第5个核苷酸G突变为A是该家系遗传性无纤维蛋白原血症的致病基因,该突变为国内首次报道的致病基因突变。2剪接位点突变后导致异常m RNA剪接,3号外显子跳读形成截短的γ链,是该家系纤维蛋白原不能正常合成的可能发病机制。