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背景与目的化疗是目前肺癌综合治疗的重要手段,但肿瘤细胞的耐药是导致化疗失败的重要原因。肿瘤细胞的耐药是一个多因素、多阶段的复杂过程,涉及关键基因的遗传学及表观遗传学调控异常。DNA甲基化修饰导致的分泌型卷曲相关蛋白1（secreted frizzled related protein 1,SFRP1）表达下调进而激活Wnt信号通路,与细胞的生长、分化、凋亡及肿瘤细胞恶性表型的形成有着密切的关系。本研究旨在探寻DNA甲基化对SFRP1蛋白表达的影响及SFRP1对人肺腺癌细胞化疗敏感性的调节作用,利用体内、外模型及临床组织标本,从细胞增殖、凋亡、细胞周期和上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）等方面探讨SFRP1参与调节人肺腺癌细胞化疗敏感性的机制。材料与方法1.MTT法测定人肺腺癌细胞SPC-A1和多西他赛耐药细胞株SPC-A1/DTX对多西他赛和紫杉醇敏感性差异;用DNA甲基化转移酶（DNAmethyltransferase,DNMT）抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR）处理SPC-A1/DTX细胞后对紫杉类药物敏感性的变化;克隆形成实验测定5-Aza-CdR对SPC-A1/DTX细胞体外增殖能力的影响;流式细胞术检测5-Aza-CdR对SPC-A1/DTX细胞凋亡率的影响。2.利用DNA甲基化芯片技术,筛选SPC-A1及SPC-A1/DTX细胞的DNA甲基化差异表达谱,对结果进行甲基化特异性PCR（methylation-specificPCR,MSP）验证;分别以不同浓度的5-Aza-CdR处理SPC-A1/DTX细胞,荧光实时定量PCR（real-time PCR）和western blot比较SFRP1表达水平差异。3.利用基因表达芯片技术对SPC-A1和SPC-A1/DTX细胞基因差异表达谱进行筛选,以real-time PCR和western blot对结果进行验证。4.选定SFRP1为研究对象,通过SFRP1基因表达载体（pcDNA3.1/SFRP1）和干涉载体（pSil/shSFRP1）并分别转染人肺腺癌SPC-A1/DTX、SPC-A1、A549/Taxol以及A549细胞,人为改变细胞内SFRP1表达水平,MTT法测定细胞对紫杉类药物敏感性差异;克隆形成实验测定细胞体外增殖能力差异;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率差异。5.以稳定表达SFRP1的SPC-A1/DTX和A549/Taxol及其对照组细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后分别定时给予多西他赛或紫杉醇腹腔注射并绘制肿瘤生长曲线,适时处死动物后取瘤体组织,免疫组化染色检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）阳性率差异。6.以real-time PCR和western blot分别检测SPC-A1/DTX细胞和SPC-A1 细胞、A549/Taxol细胞和A549细胞、稳定表达SFRP1的SPC-A1/DTX细胞和A549/Taxol细胞中Wnt信号通路及其调控靶分子的表达;通过双荧光素酶报告基因实验进一步验证SFRP1在SPC-A1/DTX细胞对于Wnt信号通路活性的影响。7.MTT法测定Wnt信号通路抑制剂FH535处理人肺腺癌耐药细胞后对紫杉类药物敏感性的差异;克隆形成实验测定FH535处理后细胞体外增殖能力的差异;流式细胞术检测FH535处理后细胞周期及凋亡率差异。8.选取33例使用过包含多西他赛化疗方案的早期肺腺癌患者的肿瘤组织样本,通过免疫组化检测组织中SFRP1表达情况,结合临床信息分析与临床预后的关系。9.通过real-time PCR、western blot、transwell、细胞划痕实验比较SPC-A1/DTX细胞与亲本SPC-A1细胞间细胞形态、EMT相关分子标志、细胞的侵袭及迁移能力等EMT表型在细胞和活体动物水平的差异;人为上调SFRP1的表达水平对于SPC-A1/DTX细胞EMT表型的影响。10.以real-time PCR、western blot、transwell、细胞划痕等实验证实细胞因子TGF-β1对于A549细胞形态、EMT相关分子标志、细胞的侵袭及迁移能力等方面的影响,人为上调SFRP1的表达水平对于A549细胞EMT表型的影响。结果1.与亲本SPC-A1细胞相比,SPC-A1/DTX细胞对多西他赛和紫杉醇呈现较高的耐药性,5-Aza-CdR处理SPC-A 1/DTX细胞后,明显增强细胞对于紫杉类化疗药的敏感性（p<0.01）;同时5-Aza-CdR可抑制细胞体外增殖能力,显著增加细胞凋亡率（p<0.01）。2.在△beta>0.8条件下,SPC-A1/DTX细胞较亲本SPC-A1细胞存在DNA甲基化差异的基因共有16条,其中包含SFRP1。MSP亦证实SPC-A1/DTX细胞中SFRP1基因的甲基化状态明显高于SPC-A1。以不同浓度的5-Aza-CdR处理SPC-A1/DTX细胞后,SFRP1的mRNA和蛋白表达水平均较未处理组明显升高。3.SPC-A1/DTX细胞较SPC-A1亲本细胞表达降低倍数大于15.0的基因共有13条,其中SFRP1 降低了24.15倍,real-time PCR和western blot亦证实了这一结果。4.在SPC-A1/DTX和A549/Taxol细胞中过表达SFRP1后,细胞对多西他赛和紫杉醇敏感性均显著提高,细胞体外增殖能力下降,细胞凋亡率增加,细胞周期中S期比例减少并出现显著的G1期阻滞（p<0.01）;相反,在SPC-A1和A549细胞中人为下调SFRP1表达水平后,亲本细胞对紫杉类药物敏感性显著降低,体外增殖能力上调,细胞周期中G1期比例减少和S期比例增加（p<0.01）。5.在裸鼠移植瘤模型中,SFRP1能够协同多西他赛或者紫杉醇抑制SPC-A1/DTX细胞或者A549/Taxol细胞的成瘤能力,显著增加耐药细胞对紫杉类药物的反应性,并诱导瘤体组织内PCNA表达降低。6.SPC-A1/DTX细胞和A549/Taxol细胞较亲本SPC-A1细胞和A549细胞Wnt信号通路及其调控靶分子的表达水平升高;在肺腺癌耐药细胞中稳定表达SFRP1后,可明显抑制Wnt信号通路活性。7.Wnt信号通路抑制剂FH535可显著增加SPC-A1/DTX细胞和A549/Taxol细胞对多西他赛和紫杉醇的敏感性,抑制细胞增殖能力,有效减少细胞周期中S期比例并诱导G1期阻滞,增加细胞凋亡率（p<0.01）,与人为上调SFRP1时获得的体外效应相似。8.在肺腺癌临床组织样本中,SFRP1低表达者无病生存期（disease-free survival,DFS）明显低于SFRP1高表达者,提示肺腺癌组织中SFRP1表达水平与临床预后相关。9.与亲本SPC-A1细胞相比,SPC-A1/DTX细胞的体积较大,呈不规则多边形,细胞融合前具有较多细长的伪足。SPC-A1/DTX细胞中上皮细胞标记分子E-钙粘蛋白（E-cadherin）和细胞角蛋白-19（Cytokeratin-19）表达下降,间质细胞标记分子N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达上升,通过体内、外实验均证实耐药细胞的侵袭及迁移能力增强,发生了 EMT的转换。人为上调SFRP1后,可以逆转SPC-A1/DTX细胞的EMT表型。10.A549细胞经TGF-β1处理后,细胞变长,伸出细长的伪足,细胞间隙增加,黏附力减弱,并且上皮细胞标志蛋白E-cadherin和Cytokeratin-19表达水平下降,间质细胞标志蛋白N-cadherin和Vimentin表达水平上升,细胞侵袭迁移能力增强,发生了EMT转变,并且Wnt通路活性升高。在A549细胞中稳定表达SFRP1后,从体内、外实验均证实SFRP1可以抑制肺腺癌细胞的侵袭能力,逆转EMT表型。Wnt信号通路抑制剂FH535处理效果与人为上调SFRP1时获得的体外效应相似。结论与意义1.DNA甲基化是参与调控人肺腺癌耐药细胞SFRP1表达下调的重要方式。2.通过拮抗Wnt信号通路,SFRP1可在体内、外对肺腺癌细胞产生显著的紫杉类药物化疗增敏作用,同时伴有细胞增殖受阻、凋亡增加、细胞周期分布及EMT表型的明显变化。3.首次探讨了 SFRP1在肺腺癌耐药细胞中表达下调的原因及与化疗敏感性的关系,提示SFRP 1有望成为临床逆转肺腺癌化疗耐药的一个新型分子靶点。4.探讨了 SFRP1在肺腺癌细胞发生EMT过程中的作用,为肺腺癌转移的干预提供了新的分子靶点,也为临床有效治疗肺腺癌提供了新思路。