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研究背景重型颅脑损伤有较高的死亡率和致残率。重型颅脑损伤昏迷的部分患者中会出现过度的阵发性交感神经兴奋(Paroxysmal sympathetic hyperactivity,PSH)症状,主要表现为:周期性发作的高血压、心动过速、呼吸急促、发热、出汗和肌张力障碍,并最终导致颅外器官的功能衰竭,不仅给重型颅脑损伤患者的处理带来极大困难,亦可直接增加致死率和致残率。但是人们对它的发病机制和病理生理变化尚无充分的认识,这给临床治疗带来巨大困难。研究发现头端延髓腹外侧区(Rostral ventrolateral medulla,RVLM)是交感兴奋输出的重要中枢和出口,RVLM内氧化应激是机体交感兴奋和神经源性高血压的重要病理生理基础。已经有研究表明还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH)氧化酶是氧化应激产生的关键酶,NOX2(gp91phox)是氧化应激产生的主要亚基,颅脑损伤后RVLM内NADPH氧化酶表达增加使氧化应激产物产生过多,最终可导致机体交感兴奋的产生。虽然有研究显示颅脑损伤后部分脑区(大脑皮层、海马和矢状窦旁脑组织等)的小胶质细胞激活可引起NADPH氧化酶表达增加。但是到目前为止,尚未见关于颅脑损伤后RVLM内小胶质细胞激活的研究报道。小胶质细胞激活与颅脑损伤后机体交感兴奋之间的关系尚不清楚。为明确RVLM内小胶质细胞激活在颅脑损伤后交感兴奋中的作用及其发生机理,本文利用弥漫性轴索损伤(Diffuse axonal injury,DAI)模型,探讨了小胶质细胞激活在DAI后RVLM内NADPH氧化酶激活中的作用及对机体交感活性的影响,为PSH治疗提供新的思路。一、大鼠弥漫性轴索损伤后RVLM内小胶质细胞激活情况目的:1、探索DAI后RVLM内是否存在小胶质细胞的激活;2、明确小胶质细胞激活抑制剂米诺环素对DAI后RVLM内小胶质细胞激活的作用。方法:250g-300g成年健康雄性SD大鼠54只,随机分为正常对照组6只、DAI组36只、DAI+米诺环素48 h组12只。DAI组和DAI+米诺环素48h组大鼠建立弥漫性轴索损伤模型。再将DAI组存活大鼠按24 h、48 h和72 h三个时间点各随机分为三个亚组,并且保证每个亚组至少6只大鼠存活。DAI+米诺环素48 h组也要保证至少有6只大鼠存活。其中,dai+米诺环素48h组分别在致伤前4h和致伤后4h、8h、12h经尾静脉向大鼠体内注射米诺环素10mg/kg。在dai后24h、48h和72h三个时间点,取rvlm区域脑组织做石蜡切片,利用免疫荧光技术标记rvlm内小胶质细胞标记物iba-1,了解rvlm内小胶质细胞激活情况,以及米诺环素对小胶质细胞激活的作用。结果:1、dai后24h至72h,可发现rvlm内小胶质细胞激活呈现上升趋势,较正常对照组有显著统计学差异(p<0.05);2、米诺环素能够明显抑制伤后48h大鼠rvlm内小胶质细胞激活,较同期dai组有显著统计学差异(p<0.05)。结论:1、dai后rvlm内有小胶质细胞的明显激活,且72h内逐渐增强;2、小胶质细胞激活抑制剂米诺环素对dai后rvlm内小胶质细胞激活有明显抑制作用。二、大鼠弥漫性轴索损伤后小胶质细胞在rvlm内nadph氧化酶系统激活中的作用目的:1、研究大鼠dai后rvlm内是否有nadph氧化酶亚基nox2(gp91phox)表达的增加;2、研究小胶质细胞激活抑制剂米诺环素是否可使dai后rvlm内nadph氧化酶亚基nox2(gp91phox)的表达下调或抑制;3、根据上述研究结果,明确小胶质细胞在dai后rvlm内nadph氧化酶系统激活中的作用。方法:250g-300g成年健康雄性sd大鼠78只,随机分为正常对照组6只、dai组36只以及dai+米诺环素组36只。dai组和dai+米诺环素组大鼠建立弥漫性轴索损伤模型。再将dai组和dai+米诺环素组存活大鼠按24h、48h和72h三个时间点各随机分为三个亚组,并且保证每个亚组至少6只大鼠存活。其中dai+米诺环素组分别在致伤前4h和致伤后4h、8h、12h分别以米诺环素10mg/kg经尾静脉注射入大鼠体内。伤后24h、48h、72h,取大鼠全脑冰冻保存。利用western-blot技术检测rvlm内nadph酶亚基nox2(gp91phox)表达变化情况。结果:1、dai组rvlm内nox2(gp91phox)的表达明显增高,伤后呈上升趋势,各亚组较正常对照组均有显著统计学差异(p<0.05);2、dai+米诺环素组24h和48hnox2(gp91phox)的表达明显低于dai组相应时间点,有显著统计学差异(p<0.05);dai+米诺环素组72hnox2(gp91phox)的表达与dai组72h相比,虽有减低,但无显著统计学差异(p>0.05)。结论:1、大鼠rvlm内nox2(gp91phox)的表达在dai后有显著增加;2、小胶质细胞激活抑制剂米诺环素对大鼠dai后rvlm内nox2(gp91phox)的表达有显著抑制作用;3、随着米诺环素在大鼠体内的代谢,对nox2(gp91phox)表达的抑制作用也逐渐减弱;4、小胶质细胞在dai后rvlm内nadph氧化酶系统的激活中起重要作用。三、大鼠弥漫性轴索损伤后小胶质细胞激活对机体交感兴奋性的影响目的:1、探索大鼠dai后交感兴奋性(血压、心率)变化情况;2、明确小胶质细胞激活抑制剂米诺环素是否可降低dai后机体交感兴奋性,探索小胶质细胞激活对dai后机体交感活性的影响。方法:250g-300g成年健康雄性sd大鼠104只,随机分为正常对照组8只、dai组48只、dai+米诺环素组48只。dai组和dai+米诺环素组大鼠建立弥漫性轴索损伤模型。再将dai组和dai+米诺环素组存活大鼠按24h、48h和72h三个时间点各随机分为三个亚组,并且保证每个亚组至少8只大鼠存活。dai+米诺环素组在致伤前4h和致伤后4h、8h、12h分别以米诺环素10mg/kg经尾静脉注射入大鼠体内。伤后24h、48h和72h通过股动脉置管连续监测血压和心率2h,并利用mpa多道生物分析系统统计分析大鼠血压、心率。结果:1、大鼠dai后24h、48h、72h,交感兴奋性(血压分别为:133.17±4.70mmhg、138.78±4.52mmhg、142.30±4.09mmhg;心率分别为:407.09±9.89次/分、417.73±12.29次/分、459.06±9.85次/分)呈上升趋势,较正常对照组(血压:116.64±6.28mmhg;心率:373.84±11.25次/分)有显著统计学差异(p<0.05);2、小胶质细胞抑制剂米诺环素对大鼠dai后交感兴奋性增加有抑制作用,24h(血压:124.09±5.36mmhg;心率:395.96±9.17次/分)最明显,与dai24h相比,有显著统计学差异;48h(血压:135.11±2.99mmhg;心率:409.50±11.0次/分)和72h(血压:140.20±4.27mmhg;心率:453.46±10.72次/分)虽也有交感兴奋性降低的变化趋势,但与dai48h和72h相比,无显著统计学差异。结论:1、大鼠dai后72h内有交感兴奋性的显著增高;2、小胶质细胞抑制剂米诺环素对dai后机体交感兴奋性增高有明显抑制作用;随伤后时间的增加,对机体交感兴奋的抑制作用也逐渐减弱;提示小胶质细胞激活在dai后机体交感兴奋中起重要作用。