目的:口腔癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,在全身恶性肿瘤中其排在第六位(位于肺、胃、乳腺、直肠以及宫颈癌之后),近些年来世界范围内口腔癌的发病率呈逐年增高的趋势,该病每年的新发数超过50万。我国人口众多,属于口腔癌高发地区,其中常见的有舌癌、牙龈癌、颊癌等,其发病原因到目前尚未完全明确,可能是由多种综合性的因素引起,如精神方面、环境方面以及免疫方面等因素。如今,众多学者已经开始密切关注并着手研究免疫方面的因素。通过相关研究证明,无论是早期还是晚期的口腔癌病人,其免疫功能均可能比正常人群出现下降,然而在晚期患者中则更为明显。所以,在口腔恶性肿瘤的发生、发展过程中人体的免疫功能状态变化可能具有相关的参考价值。近年来研究发现,具有免疫调节功能的一类T细胞,即CD4~+CD25~+调节性T细胞,(regulatory T cells,Tregs)在抗肿瘤免疫过程中起着非常重要的作用,它可以通过下调人体内的免疫应答水平,来减弱宿主的抗肿瘤免疫作用,从而成为当今医学领域研究的热点。还有相关的研究表明,FOXP3主要存在于活化的CD4~+CD25~+ T淋巴细胞表面,对其发育及功能的发挥起了相当重要的作用。本实验目的在于通过流式细胞学技术,来精确检测口腔癌患者手术前、后外周血中T淋巴细胞各种亚型和CD4~+CD25~+ Treg的表达情况,并通过分析口腔癌病人血中CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3的表达水平与其细胞免疫的状态、手术对上述淋巴细胞表达水平的影响,从而更加深入的探讨其与口腔癌病人手术前后免疫状况的关系和临床意义,在口腔癌的免疫治疗中提供可靠的理论依据。方法:取100μl每份的静脉血共8份,各自加入10μl由FITC标注的CD3单克隆抗体和CD4单克隆抗体;由PE标注的CD8及CD56单克隆抗体各10μl;10μl由PE标注的Fas单克隆抗体;由FITC标注的CD4单克隆抗体以及PE标注的Fas单克隆抗体各10μl;10μl由PE标注的FasL单克隆抗体;由FITC标注的CD4单克隆抗体与PE标注的FasL单克隆抗体各10μl;在室温条件下孵育1小时并且避光,然后再加入红细胞裂解液,使红细胞裂解5分钟,再加入PBS液以便清除血红蛋白,在1mlPBS液内使其重新悬浮,最后T淋巴细胞各表型采用流式细胞仪检测其百分比,以及CD4~+Fas~+和CD4~+FasL~+ T细胞所占比例,FasL~+及Fas~+T细胞的百分比,并得出CD4~+与CD8~+的比值。另外再取2份100μl的静脉血,分别加入20μl由FITC标注的CD4单克隆抗体,20μl由APC标注的CD25单克隆抗体,同样是避光在室温下孵育1小时,再加入红细胞裂解液以便裂解红细胞5分钟,用PBS液祛除其内的血红蛋白,再次悬浮在1mlPBS液内,然后加入10μl由PE标注的FOXP3,再次避光室温下孵育1小时,最后使用流式细胞仪测出CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3 T细胞的比例。结果:1口腔癌患者各项免疫指标在手术前后的变化1.1口腔癌患者术前外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD56~+T淋巴细胞所占比例分别为56.43±9.44%,29.54±4.88%,31.42±10.95%,21.43±6.03% ,CD4~+/CD8~+比值范围为0.91±0.32;健康对照组外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD56~+T淋巴细胞所占比例分别为68.81±6.55%, 42.50±7.56%,24.77±6.25%,11.78±2.87% ,CD4~+/CD8~+比值范围为1.73±0.56。1.2口腔癌患者经手术治疗,一周后再次采集其外周血,检测外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD56~+ T淋巴细胞所占比例分别为67.65±2.64%,41.05±4.92 , 25.06±3.38% , 15.81±2.31% , CD4~+/CD8~+比值范围为1.59±0.18。术后CD3的表达较术前明显提高,存在统计学意义(P﹤0.05);其与健康对照组相比,不具有统计学意义(P>0.05),可以认为CD3的表达与健康对照组的差别没有显著性; CD4的表达水平在术后与术前相比有明显提高,有统计学意义(P﹤0.05),但与健康对照组相比则无统计学意义(P>0.05);CD8的表达术后比术前明显降低(P﹤0.05),同时与正常对照组之间的差别无显著性(P>0.05);CD4/CD8比值术后与术前相比明显回升,且与正常对照组无显著性差异(P>0.05);CD56的表达术后明显低于术前(P﹤0.05),与对照组比相则无统计学意义(P>0.05)。2手术前后口腔癌患者外周血中Fas、FasL的变化口腔癌病人手术前外周血中CD4~+FasL~+、CD4~+Fas~+、FasL~+、Fas~+T淋巴细胞所占的比例分别是22.65±7.02%,29.22±5.19%,0.60±0.24%和36.05±6.28%,术后值则为:28.80±7.53%,24.58±7.25%,0.92±0.34%和37.93±5.65%; CD4~+FasL~+,FasL~+和Fas~+的表达水平术后较术前有明显提高(P﹤0.05),CD4~+Fas~+的表达术后比术前明显降低(P﹤0.05)。3手术前后口腔癌病人外周血中的CD4~+CD25~+T细胞以及CD4~+CD25~+FOXP3 T细胞的变化3.1术后口腔癌患者外周血中CD4~+CD25~+T细胞和CD4~+CD25~+FOXP3 T细胞所占的比例分别为30.93±3.55%和65.34±3.43%。CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3 T细胞的表达水平较术前都明显降低,存在统计学意义(P﹤0.05),但均高于正常对照组(P﹤0.05)。3.2不同临床因素与CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3表达的关系3.2.1 CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3在口腔癌病人外周血中的表达显著较正常对照组高(P﹤0.05),其水平在Ⅲ~+Ⅳ期患者中远远高于Ⅰ和Ⅱ期患者(P﹤0.05);口腔癌病人伴有淋巴结转移者CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3 T细胞的表达显著高于无淋巴结者(P﹤0.05)。3.2.2年龄大小、性别、吸烟与否等因素与口腔癌患者外周血中CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3的表达无明显相关性。结论:1与健康人相比较,口腔癌患者的辅助性T淋巴细胞表达水平降低,抑制性T淋巴细胞表达则升高,机体的免疫功能出现不同程度降低的情况,通过手术去除瘤负因素后,可以在一定程度上解除机体内免疫功能受到的抑制,所以手术对口腔癌患者的治疗是有效的。2对口腔癌患者来说,其外周血中Fas和FasL的表达水平或许可以成为评估口腔癌病人治疗过程中评价人体免疫功能的一个免疫学指标。3对于口腔癌患者来说,其外周血中CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3表达水平可能均与恶性肿瘤分期以及出现淋巴结转移相关。4手术切除肿瘤1周,外周血中CD4~+CD25~+FOXP3表达水平较术前明显下降,可考虑减少瘤负因素后,机体的免疫抑制情况减轻,从而使免疫功能有所恢复。5口腔癌病人外周血中CD4~+CD25~+和CD4~+CD25~+FOXP3的表达可能成为监测机体免疫状态的一种临床指标。