灰霉菌侵染木纳格葡萄导致果梗采后褐变的机制研究

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木纳格葡萄(Vitis vinifera L.cv Munage)是闻名中外的优质鲜食葡萄品种,也是新疆南疆地区最为丰产高效的主栽葡萄品种。但木纳格葡萄采收后,由于灰霉菌的侵染而使果梗发生褐变,导致葡萄贮藏期缩短,品质下降,严重影响了鲜食葡萄产业的健康可持续发展。因此,明确灰霉菌引起葡萄果梗褐变的机理,可为实际生产中控制葡萄果梗褐变、延长果实贮藏期和销售期以及研制防褐变的生物制剂,提供理论依据。本文以南疆阿图什鲜食葡萄木纳格为材料,从研究接种灰霉菌后葡萄果梗在不同贮藏期生理生化变化出发,分析活性氧代谢与果梗褐变的关系;进一步利用RNA-seq测序技术,通过生物信息学分析,挖掘灰霉菌侵染导致褐变的相关通路和候选基因;结合转录组结果从细胞壁降解的角度开展了灰霉菌诱导褐变的深入分析;采用HPLC-MS技术分析果梗褐变过程中褐变底物的变化;结合转录组结果解析灰霉菌侵染导致葡萄采后果梗褐变的机制。本研究主要取得以下结果:(1)通过分析采前接种灰霉菌对木纳格葡萄采后果梗褐变发生的影响可知,处理中穗轴和花梗中含水率高于对照,灰霉菌胁迫引起的褐变不是失水导致的。灰霉菌胁迫导致木纳格葡萄果梗在采后贮藏过程中PPO和POD酶活性升高,总酚、类黄酮加速分解,促进褐变。灰霉菌降低了果梗中活性氧抗氧化酶SOD、CAT和APX的活性以及非酶抗氧化物质As A和GSH的含量,促进了活性氧H2O2的积累,提高了O2·-的产生速率,导致MDA含量升高,加速褐变。(2)采用转录组技术分析了灰霉菌对木纳格葡萄果梗褐变候选途径和基因的影响。穗轴中鉴定到了6357个差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs),花梗中鉴定到DEGs为3665个。GO分析表明,果梗褐变过程中次生代谢过程、氧化还原酶活性、肉桂酸代谢过程、苯丙烷代谢过程和细胞壁是主要的富集条目,尤其是细胞壁。KEGG分析表明,苯丙烷生物合成是果梗褐变过程中的主要富集途径,其次是类黄酮的生物合成。WGCNA分析表明,果梗褐变核心基因主要分布在ERF、b HLH、MYB、NAC和WRKY转录因子家族中。挖掘出褐变相关DEGs是参与苯丙烷生物合成中的PAL2、4CL和类黄酮生物合成途径中的CHS、CHI以及参与细胞壁合成和修饰的相关基因PG、PE、β-Gal、Cx和XYL。(3)深入探讨了灰霉菌对木纳格葡萄果梗褐变过程中细胞壁降解的诱导作用。灰霉菌诱导了葡萄果梗中Vv PG、Vv PME1、Vvβ-Gal、Vvβ-glu和Vv BG1基因的表达,提高了细胞壁降解酶(Cell Wall Degradation Enzymes CWDEs)如PG、PME、β-Gal和Cx的活性,增强了细胞壁组成成分 WSP、NSP、CSP、纤维素、半纤维素的降解,促进了葡萄果梗细胞壁结构的破坏,细胞之间区室分隔被破坏。相应地,细胞结构的破坏又加速了灰霉菌的侵染与繁殖,从而恶性循环,褐变程度加重。(4)通过研究灰霉菌诱导木纳格葡萄果梗褐变过程中褐变底物-酚类物质(酚酸和类黄酮)的变化发现,木纳格葡萄果梗中含有33种酚类化合物,其中酚酸17种(肉桂酸类6种、苯甲酸类11种),类黄酮16种(黄烷-3-醇类2种、黄酮醇类7种、黄烷酮类2种、黄酮类5种)。灰霉菌侵染加速了果梗中咖啡酸、对香豆酸和儿茶素的转化。同时,果梗中醌含量增加,说明咖啡酸、对香豆酸和儿茶素可能是灰霉菌诱导木纳格葡萄果梗褐变发生的底物。(5)解析了灰霉菌对酚类物质合成的调控。灰霉菌显著诱导了果梗中Vv PAL2和Vv HCT的表达,抑制了Vv4CL的表达;上调了穗轴中Vv CHI、Vv FLS5、Vv F3H、Vv LAR2和Vv LDOX的表达,但只上调了花梗中Vv CHI和Vv FLS5的表达。从而促进了果梗中酚类物质的合成,为褐变提供了充足的底物,进而导致醌含量的增加,加速了褐变进程。
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