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弓形虫是一种宿主范围广泛的人畜共患寄生虫,可感染包括人在内的所有温血动物,全世界约有四分之一的人口感染弓形虫病。免疫力正常的宿主感染弓形虫后,在宿主免疫压力的作用下,弓形虫会在宿主体内转变成缓殖子,以组织包囊形式存在,造成机体的终生慢性感染。当机体的免疫力下降时,包囊内的缓殖子会再活化,形成速殖子,造成宿主急性感染。弓形虫速殖子与缓殖子相互转化在弓形虫病传播与发病中起到重要作用。在弓形虫速殖子与缓殖子相互转化过程中,约有400个基因的表达会发生明显变化,但是这些基因在缓殖子形成中的作用仍不清楚,而鉴定它们在缓殖子形成中的作用可以为理解缓殖子发育的分子机制奠定基础,,为弓形虫疫苗设计提供理论依据。本研究选取一个含有三十四肽重复结构域的缓殖子期上调基因ANK1,利用CRISPR/Cas9系统将ANK1基因在PRU株中敲除,获得了ANK1基因缺失株,通过比较敲除株与野生株生长、复制和毒力的差异,发现与野生株相比,敲除株在生长、复制和毒力方面均有缺陷。具体工作包括以下几个方面:(1)ANK1蛋白N-端及全长的原核表达构建pE-SUMO-ANK1-Nter和pE-SUMO-ANK1原核表达质粒,将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中并进行原核表达。在37℃诱导条件下,ANK1蛋白N端和全长均能得到高效表达,但ANK1蛋白全长主要以包涵体的形式存在。优化诱导表达条件发现,当大肠杆菌OD600值达1.5时,16℃用终浓度为0.1mM的IPTG诱导可提高蛋白在上清中的表达量。(2)ANK1敲除株的构建利用CRISPR/Cas9系统对ANK1基因进行敲除。首先,构建ANK1基因特异性CRISPR质粒pSAG1-Cas9-U6-ANK1和同源模板质粒pANK1-DHFR,然后将同源模板片段和pSAG1-Cas9-U6-ANK1质粒共电转到PRU速殖子中,用乙胺嘧啶进行筛选并用限制稀释法在96孔板中获取单克隆,经扩大培养后用PCR进行鉴定,结果显示成功获得ANK1敲除株。(3)ANK1敲除株表型研究通过空斑实验比较敲除株和野生株生长的差异,发现敲除株的生长明显比野生株慢;通过复制实验比较野生株和敲除株在虫体复制方面的差异,发现与野生株相比敲除株在复制方面有明显的缺陷;通过小鼠毒力实验比较野生株和敲除株对小鼠的毒力情况,发现与野生株相比,敲除株的毒力明显下降。小鼠保护力实验显示,经ANK1敲除株免疫的小鼠对致死剂量的野生型虫株有很好的抗性,证明了敲除株的免疫保护性为100%。(4)RNA-seq寻找野生株与敲除株的基因表达差异体外培养敲除株和野生株获得速殖子,体外碱性诱导敲除株和野生株形成缓殖子,提取速殖子和缓殖子RNA,利用RNA-seq寻找野生株与敲除株表达量有差异的基因。本研究中,共找到430个缓殖子期敲除株和野生株表达量有差异的基因;510个速殖子期敲除株和野生株表达有差异的基因。本研究利用CRISPR/Cas技术将ANK1基因在PRU中进行敲除,成功获得单克隆敲除株。与野生株PRU比较发现,敲除株在生长、复制和小鼠毒力方面有明显的缺陷,并且敲除株对小鼠具有很好的保护力,有成为基因工程疫苗的潜力。通过RNA-seq发现敲除株和野生株在缓殖子期有430个基因的表达量有明显差异,而在速殖子期有510个基因的表达量有明显差异,为进一步研究ANK1影响弓形虫生长发育的分子机制奠定了基础。