【摘 要】
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猪IGF2基因与哺乳动物肌肉生长发育密切相关,其3号内含子中3072位单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点G→A的突变已被证实可以有效提高肌肉产量。鉴于基因编辑生物安全和社会舆论问题,本研究提出了针对猪IGF2基因的“SNP编辑”,即针对该SNP位点从野生型G到自然突变型A的“精准”编辑。本土猪种的SNP编辑研究对我国猪种改良和种质资源开发具有
【基金项目】
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国家自然科学基金（31702099）； 中国博士后科学基金（2015M580887）；
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猪IGF2基因与哺乳动物肌肉生长发育密切相关,其3号内含子中3072位单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点G→A的突变已被证实可以有效提高肌肉产量。鉴于基因编辑生物安全和社会舆论问题,本研究提出了针对猪IGF2基因的“SNP编辑”,即针对该SNP位点从野生型G到自然突变型A的“精准”编辑。本土猪种的SNP编辑研究对我国猪种改良和种质资源开发具有重要价值。sgRNA-shRNA串联表达技术是课题组前期开发的将sgRNA和shRNA协同表达的创新性技术。其中,sgRNA可以用于介导Cas9进行有效的基因编辑,而shRNA可以用于RNA干扰抑制目标基因的表达。利用RNA干扰技术抑制非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）通路关键基因LIG4的表达可以有效提高同源介导修复（homology-directed repair,HDR）的效率。CRISPR/StCas9系统为课题组前期开发的源于嗜热链球菌的基因编辑系统,与酿脓链球菌来源的CRISPR/Sp Cas9系统具有相近的打靶效率。本研究采用sgRNA-shRNA/StCas9系统介导HDR的编辑策略,以单链DNA（single-stranded DNA,ssDNA）供体为同源修复模板,针对猪IGF2基因进行SNP编辑。主要内容如下:（1）根据LIG4基因序列,构建了针对LIG4基因的3个shRNA表达载体（Sh-1、Sh-2、Sh-3）和阴性对照载体（SC）。通过嘌呤霉素筛选富集转染阳性细胞,利用RT-q PCR检测各组LIG4 mRNA的相对表达量,与SC组相比,Sh-1、Sh-2和Sh-3均显著抑制了LIG4基因的表达,其中Sh-1干扰效果最佳。（2）选取Sh-1 shRNA,设计ILI串联表达盒（IGF2.sgRNA-LIG4.shRNA-IGF2.sgRNA）,构建相应的表达载体（Sg-Sh）及打靶载体（pll3.7-ILI-h StCas9）。初步的shRNA和sgRNA活性验证结果表明:Sg-Sh与Sh-1干扰活性相近;ILI.Sg-Sh/h StCas9与IGF2.sgRNA/h StCas9具有相近的打靶活性（分别为38.37%和32.33%,p=0.265）。（3）将打靶载体、ssDNA供体以及p SSA.RPG.IGF2报告载体共转染PK15细胞,通过嘌呤霉素筛选富集、RFLP分析、Sanger测序以及扩增子深度测序分析,验证采用sgRNA-shRNA/StCas9系统对IGF2基因的SNP编辑效率。结果表明:较常规的sgRNA/StCas9系统（11.65%）,sgRNA-shRNA/StCas9系统有效提高了基于HDR机制的IGF2基因SNP编辑效率（16.38%）。综上所述,本研究借助sgRNA-shRNA串联表达技术实现了RNAi技术与CRISPR/StCas9基因编辑技术的完美结合,有效提高了基于HDR机制的猪IGF2基因SNP编辑效率;丰富了CRISPR/Cas9技术体系,为基因编辑动物制备提供了新的思路借鉴和技术参考。
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