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茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是引起山核桃干腐病的病原菌,易侵染枝干部位,造成全株死亡,导致严重经济损失。抗病品种的培育过程中发现分别以湖南山核桃和美国山核桃为砧木、浙江山核桃为接穗的嫁接苗抗性好、产果率高,目前已广泛种植,但关于其抗病机理还缺乏研究。前期研究发现发病严重的山核桃体内酚类物质以及相关酶——苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)都比抗病山核桃品种中含量低,这些指标对抗病性的鉴定起重要作用,因此还需要对山核桃受B.dothidea侵染后抗性反应中酚类物质的合成开展进一步的研究。本研究以湖南嫁接山核桃(HG)、美国嫁接山核桃(AG)和浙江山核桃(ZJ)为材料,对接种B.dothidea后不同品种山核桃的感病情况和侵染状况做分析;测定了不同品种中总酚、总黄酮的含量,并对与防御相关的酶活(PAL、PPO、POD、肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)、细胞壁水解酶)进行了分析;同时对山核桃防御途径中苯丙烷代谢途径的几个关键基因:苯丙氨酸解氨酶基因(PAL基因)、肉桂酸-4-羟基化酶基因(C4H基因)、4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL基因)4CL和查尔酮合成酶(CHS基因)进行了克隆与序列分析,对不同侵染时期基因的表达动态进行了研究。主要结果如下:1.人工接种B.dothidea后浙江山核桃最易感病,湖南嫁接山核桃最抗病。山核桃的感病程度依次为:ZJ>AG>HG。扫描电镜观察到,B.dothidea菌丝在寄主表面的伤口发生侵染,前期菌丝附着在寄主表面;中期时菌丝侵入表皮结构,在表皮层中逐渐扩展形成网状;后期菌丝进入到组织结构内,包裹组织结构,破坏组织形态。同一时期感病品种受侵染情况比抗病品种严重。2.B.dothidea侵染后,HG的总酚、总黄酮含量显著高于ZJ,AG的含量则略低于HG。苯丙烷代谢途径的关键酶PAL在三个品种中都出现先上升后下降的趋势,但抗病品种接种后酶活性快速积累,显著高于感病品种。HG在接种后POD和PPO活性都表现出升高,而ZJ品种无明显的波动变化。HG和AG中β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)受到诱导后呈上升趋势,相反ZJ表现出下降的反应。接种后所有品种的几丁质酶都呈波动的变化,品种间活性相差不大,诱导抗性的行为不明显。3.通过PCR技术和RACE实验获得了山核桃PAL、C4H、4CL和CHS基因的全序列,结果显示:山核桃PAL基因的开放阅读框为2160 bp,可编码720个氨基酸;C4H基因含有长1521 bp的ORF,编码507个氨基酸;4CL基因含有1个长1638 bp的ORF,能编码545个氨基酸;CHS基因序列,包含了长1170 bp的开放阅读框,可编码389个氨基酸。同源性比对分析结果显示,这四个基因的核苷酸序列在三个品种中的相似度高达97%以上,均与来自胡桃科核桃属植物的序列同源性较高,在90%左右,与其他科属植物同源性在70%-85%之间。系统发育树分析发现山核桃基因序列与胡桃科聚为一支,其他为同一科的聚在一起,木本植物与草本植物的基因进化存在一定距离。4.通过实时荧光定量PCR实验测定了B.dothidea侵染后不同品种山核桃苯丙烷代谢途径关键基因(PAL、C4H、4CL和CHS)的表达动态。PAL基因在接种前期均呈现上调表达,并且山核桃的抗性越强,PAL基因表达量越大且表达时间越早。在病原菌的胁迫下,C4H基因的表达量迅速上调,嫁接品种AG和HG均在第3 d达到峰值,分别是ZJ的9.3倍和9倍。接种后4CL基因表达量存在一定差异,ZJ的相对表达量较低。山核桃抗性越好,4CL基因的表达量越高,并且接种5 d后该基因表达量也能维持在较高水平。CHS基因是类黄酮合成的关键基因,3个品种中湖南嫁接山核桃的表达显著高于其他两个品种。实验结果与山核桃不同品种酮类物质的积累以及发病情况相一致。