一、研究背景和目的皮肤作为人体最大的器官,是人体第一道屏障,可以将异物和病原体阻挡在机体之外。皮肤损伤常常形成创口或创面,若不尽早治疗,不仅影响功能,还将成为重要的感染途径,因此尽早使创口或创面愈合,对于减少机体消耗、防止内环境紊乱以及阻止微生物入侵至关重要。皮肤创伤愈合主要经历四个互相联系的阶段,分别是止血凝血阶段、局部炎症反应阶段、细胞增殖分化和肉芽组织生成阶段以及组织塑形阶段。参与皮肤创伤愈合的细胞主要有角质形成细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、肥大细胞以及巨噬细胞等。其中成纤维细胞是构成肉芽组织的主要成分之一,也是合成和分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白和透明质酸等细胞外基质的主要细胞。同时成纤维细胞也是创伤瘢痕形成的主要参与细胞,其活化、增殖、合成胶原纤维以及分化的异常直接导致病理性瘢痕的形成。创伤后成纤维细胞功能受多种因素影响,其中细胞因子对成纤维细胞的调控作用尤为重要,探寻一种即可以调控成纤维细胞参与伤口愈合,又不会引起胶原纤维过度合成导致瘢痕增多的细胞因子,是创伤愈合研究的目标之一。活化素(Activin)家族由于其Activin β亚基具有典型的TGF-β超家族结构特征因而属于TGF-β超家族成员。有研究表明,在哺乳动物生殖和胚胎发育过程、红细胞分化、病理炎症、细胞凋亡、损伤后的修复以及创伤修复后期皮肤附属器官的改建等生物学行为中都发现有Activin的表达。课题组前期研究发现Activin家族家族之一活化素B(Activin B)促进皮肤伤口快速再上皮化和毛囊再生,而皮肤伤口快速再上皮化的前提是健康的肉芽组织的快速形成。因此本研究将着重探索Activin B调节肉芽组织的主要成分之一成纤维细胞参与伤口愈合过程中的作用以及其信号机制,为阐明伤口愈合复杂的信号机制和Activin B的临床治疗应用提供研究基础。二、研究方法动物水平实验1.构建动物皮肤创伤模型:SPF级C57BL/6雌鼠,腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉小鼠,脱毛后,碘伏消毒皮肤,在皮肤暴露区域用无菌手术器械做直径8mm的圆形切口,切除的皮肤包括皮肤全层深达皮下,术后伤口露。2.分组:小鼠随机分为PBS组与Activin B组,自由饮水取食。PBS组术后伤口周围注射PBS(0.1M,PH7.4,0.5ml,每天1次);ActivinB组术后伤口周围注射 1Ong/ml ActivinB(0.5ml,每天 1 次)。3.伤口闭合率计算:在术后每天在相同条件下记录创面闭合情况,IPP图像分析系统计算创面面积,计算创面闭合率,闭合率=(原始创面面积-未闭合的创面面积)/创面原始面积×100%。4.伤口再上皮化以及肉芽组织形成:术后第3天、5天、7天,麻醉小鼠,取伤口周围0.5cm范围内的皮肤全层,石蜡包埋,切片,H&E染色观察伤口再上皮化过程以及伤口部位肉芽组织形成情况,并观察肉芽组织的内部构成变化;5.伤口部位肉芽组织中Ⅰ型胶原蛋白表达:术后第3天、5天、7天,麻醉小鼠,取伤口周围0.5cm范围内的皮肤全层,石蜡包埋,切片,免疫组织化学染色观察伤口部位肉芽组织中Ⅰ型胶原蛋白的表达;6.伤口部位肉芽组织中胶原纤维生成:术后第3天、5天、7天,麻醉小鼠,取伤口周围0.5cm范围内的皮肤全层,石蜡包埋,切片,Masson三色染色观察伤口部位肉芽组织中胶原纤维形成情况。细胞水平实验1.分离培养成纤维细胞:出生24小时内的C57BL/6乳鼠,轻取下整张皮肤,将皮肤真皮层朝下展平置于培养皿中加0.25%胰酶,4℃消化过夜。分离表皮和真皮层。取下真皮层后弃去表皮层,用弯镊反复撕拉真皮层直至真皮层完全破碎,加入全培,剧烈敲打振荡,100μm过滤器过滤,离心,全培重悬,将重悬后的细胞液接种到培养皿中培养。2.Elisa、RT-PCR:成纤维细胞传代至4至6代,分成PBS组、Activin B组,分别提取细胞上清液以及mRNA,Elisa、RT-PCR检测Activin B对成纤维细胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白以及胶原蛋白前体mRNA的影响;3.CCK8实验:成纤维细胞传代至4至6代,分别分组PBS组、Activin B组、Activin B+SP600125 组、Activin B+SL-327 组以及 Activin B+p38 组,CCK8试剂盒检测Activin B对成纤维细胞增殖影响。4.Transwell细胞趋化实验:成纤维细胞传代至4至6代,分别分组PBS组、Activin B 组、Activin B+SP600125 组、Activin B+SL-327 组以及 Activin B+p38组,Transwell实验检测Activin B对成纤维细胞的趋化作用。5.细胞划痕实验:成纤维细胞传代至4至6代,分别分组PBS组、Activin B组、Activin B+SP600125 组、Activin B+SL-327 组以及 Activin B+p38 组,检测Activin B对成纤维细胞划痕愈合情况的影响。6.Weatern Blot检测MAPK信号通路:成纤维细胞传代至4至6代,分别分组PBS组、Activin B组、Activin B+SP600125组、Activin B+SL-327组以及Activin B+p38组,提取细胞总蛋白,检测Activin B是通过何种信号通路调节成纤维细胞增殖、趋化以及迁移。三、研究结果1.动物水平,在术后第3、5天,Activin B组伤口闭合速度快于PBS组,同时Activin B组肉芽组织生成进程在术后第3、5、7天均早于PBS组,Activin B组肉芽组织在术后第3天镜下可观察到较多的成纤维细胞,术后第5天可观察到基本形成的成熟毛细血管。免疫组化以及Masson三色染色结果发现,Activin B组伤口部位成纤维细胞分泌的I型胶原蛋白以及伤口部位的胶原纤维含量与PBS组不存在明显差异,因此我们认为Activin B可促进肉芽组织的形成进而促进伤口快速再上皮化,但是Activin B不调节成纤维细胞分泌I型胶原蛋白以及伤口部位胶原纤维的形成。2.细胞水平,Activin B刺激成纤维细胞后,处于增殖状态的成纤维细胞数量在24h、48h以及72h均高于PBS组,而Transwell实验结果显示Activin B组在12h和24h下室成纤维细胞的数量多于PBS组,提示Activin B促进成纤维细胞的增殖,同时对成纤维细胞具有较强的趋化作用。此外,细胞划痕的结果显示Activin B组愈合速度也快于PBS组,因此我们认为Activin B可促进成纤维细胞增殖、趋化和迁移。3.Activin B刺激成纤维细胞后,p-JNK与p-ERK表达水平高于PBS组,p-JNK在10min,p-ERK在30min时有最高表达。进一步研究发现经过JNK抑制剂SP600125处理后,成纤维细胞增殖、趋化和迁移均受到了显著抑制;而经ERK抑制剂SL-327处理后,成纤维细胞的增殖、趋化受到了显著抑制,而划痕迁移并无明显的抑制作用,因此我们认为Activin B通过JNK、ERK/MAPK信号通路调节成纤维细胞增殖、趋化和迁移。4.Activin B刺激成纤维细胞后,p38磷酸化水平未见明显变化。p38抑制剂SB202190处理后,相对于PBS组,成纤维细胞的增殖和迁移没有明显的变化,然而成纤维细胞的趋化性受到了显著抑制。因此我们认为p38信号虽不参与介导Activin B调节成纤维细胞增殖、迁移,但是p38信号通路是成纤维细胞趋化性重要的调控分子。四、研究结论1.Activin B通过JNK、ERK/MAPK信号通路调节成纤维细胞增殖、趋化和迁移参与伤口愈合。2.p38信号通路是成纤维细胞趋化性重要的调控分子。