异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体,由于其具有出色的加工特性和生理功能,因此被作为蔗糖的替代品广泛地应用于食品、医药等诸多领域,拥有广阔的市场前景。目前工业上大多采用蔗糖异构酶生物催化蔗糖的方式实现异麦芽酮糖的生产。不同来源的蔗糖异构酶具有不同的催化效果,但不可避免存在副产物多,热稳定性差的问题。因此,挖掘能够高效生产异麦芽酮糖的菌株并且对其进行分子改造以适应异麦芽酮糖的生产需求具有重要意义。本课题鉴定了一种来源于Raoultella terrigena的蔗糖异构酶（Pal-2）,优化了重组菌株的诱导条件并对Pal-2的酶学性质进行了探究。之后,对酶法生产异麦芽酮糖的条件进行了优化,最后通过定点突变对Pal-2进行改造,获得了酶活以及异麦芽酮糖转化率均提高的正向突变体。通过基因挖掘的方式在NCBI数据库中检索到一段拟表达蔗糖异构酶的基因片段,它来源于Raoultella terrigena,登录号为Gen Bank:VUC84579.1,由599个氨基酸组成。将该片段进行密码子优化后,连接至pET-28a（+）载体上构建重组质粒pET-28a（+）-pal-2。双酶切验证成功的重组质粒经胶回收后转入E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达。通过Ni-NTA琼脂糖树脂对Pal-2进行蛋白纯化,纯化后的Pal-2进行SDS-PAGE蛋白电泳检测,结果显示Pal-2分子量大小为70 k Da,与理论值相符。通过单因素条件的优化,最终确定E.coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-pal 2重组菌株在初始菌体浓度OD600值达到0.6时,加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG,25°C条件下低温诱导12 h,达到Pal-2的最高酶活。诱导条件优化后测得粗酶液酶活为48.52 U/m L,相比于优化前提高了39.2%。Pal-2的最适温度和最适pH值分别为40℃和5.5,10 mmol/L浓度的Mg2+、Mn2+、Ca2+、Al3+等金属离子不同程度上促进其酶活。其中Ca2+提高了28.5%的酶活,Al3+提高了44.3%的酶活。通过动力学实验得到Pal-2以蔗糖为底物时的Km和Vmax分别为62.89mmol/L,286.35 U/mg。最后优化了异麦芽酮糖的合成条件,结果表明:以400 g/L的蔗糖为底物,添加25 U/mg酶液,反应6 h后异麦芽酮糖的产量达到最大326.8 g/L,异麦芽酮糖的转化率为81.7%。通过分子生物学手段结合同源建模以及半理性设计,获得8个定点突变的突变体。对8个突变体酶的热稳定性、酶活以及产物特异性进行探究,发现了对Pal-2催化性能起重要作用的位点。其中,突变体N498P、Q275R酶活分别提高了89.2%,42.2%。突变体Y246L、H287R、H481P异麦芽酮糖的转化率分别提高至89.1%、90.7%和92.4%。