人工耳蜗是现代医学最成功的人造功能器官之一，它通过将声电转化后的信号直接作用于内耳螺旋神经元从而使患者恢复或获得听力感知。目前，人工耳蜗植入是临床上治疗患有重度、极重度、甚至全聋感音神经性聋的成人以及儿童最有效的治疗措施。但是螺旋神经元在损伤或退化后不能自发再生，因此功能性螺旋神经元的数量不足是影响人工耳蜗植入术后聆听效果的重大医学难题。近年来，干细胞移植已经成为治疗神经退行性疾病最有前景的治疗手段，包括感音神经性聋。因此建立人工耳蜗植入和干细胞移植新综合技术体系有望扩展人工耳蜗植入的适应症，为更多螺旋神经元退化或损伤严重的患者带来福音。大量的基础研究已经表明干细胞移植到内耳后可以再生出神经元，能够用于再生螺旋神经元的干细胞有内耳干细胞，诱导多能干细胞，胚胎干细胞，间充质干细胞以及神经干细胞（NSCs）。然而，干细胞移植在治疗感音神经性聋的过程中仍存在很多有待解决的问题，例如干细胞植入后的存活率过低，移植的干细胞很难迁移至螺旋神经节，移植干细胞的不可控分化以及再生的神经元缺乏功能等。因此如何有效控制干细胞的行为成为关键科学问题之一。
　　组织工程材料的发展为干细胞行为调控提供了新的有效途径，组织工程材料通过模拟细胞微环境（niche），为移植的干细胞提供必要的物理支撑、三维空间及可控的物化因子等。同时由于神经元的电活动特性，所以，导电组织工程材料作为种子细胞的运输载体和调控手段，有望为人工耳蜗植入和干细胞移植新综合技术体系的临床转化提供新的思路。
　　本研究分别以成熟导电组织工程材料石墨烯和新型潜在导电生物材料碳化钛（Ti3C2Tx）做为神经界面，建立基于人工耳蜗的声电刺激体系，在体外研究人工耳蜗-导电材料声电刺激体系对于NSCs行为的调控，为导电组织工程材料应用于人工耳蜗植入和干细胞移植新综合技术体系提供理论依据，更快的实现人工耳蜗植入适应症的扩展。在本研究中，首先通过免疫荧光，蛋白印迹，电生理，钙成像等手段探索了导电衬底石墨烯和碳化钛对NSCs行为的调控规律及作用机制。其次，以此为研究基础，首次在体外建立了具有良好生物相容性的人工耳蜗-导电衬底声电刺激体系。最后，通过多种细胞生物学和分子生物学研究手段系统的揭示了人工耳蜗-石墨烯声电刺激体系对于NSCs行为的调控规律。
　　在第一部分，首先通过真空抽滤将预先制备的Ti3C2Tx溶液均匀的铺在传统细胞衬底TCPS表面，用原子力显微镜、X射线光电子能谱仪、傅里叶红外转换光谱仪等多种设备对Ti3C2Tx衬底进行表征，结果表明Ti3C2Tx衬底具有优良的导电性且含有多种含氧官能团，衬底表面具有无规则的拓扑结构。和TCPS衬底相比，Ti3C2Tx衬底同样具有良好的生物相容性，不会对NSCs产生细胞毒性，最重要的是，Ti3C2Tx衬底同样可以维持NSCs的干性和增殖潜能。然而通过钙成像实验发现增殖条件下，Ti3C2Tx可以显著提高NSCs钙瞬变的频率以及同步性。为了进一步解释该现象，分析了Ti3C2Tx对NSCs分化能力以及新生神经元的影响，结果显示Ti3C2Tx可以显著提高NSCs分化为神经元的比例，且新生神经元的复杂度更高，但是不会影响新生神经元突触的发育。以上结果说明Ti3C2Tx衬底可以作为一种卓越的神经界面材料，维持NSCs的干性和增殖潜能，促进其分化为神经元。
　　为了研究导电衬底调控NSCs行为的机制，通过化学气相沉淀法制备了结构简单、元素组成单一的石墨烯衬底。由于生物材料对细胞最直接和最明显的影响可能是在细胞膜上，而膜上的离子通道和离子泵在调控细胞功能上发挥着重要作用。因此，聚焦NSCs的被动和主动电生理特性，同时通过探索石墨烯对NSCs行为的调控阐明NSCs细胞膜生物电特性的发育和NSCs行为改变的关系。在对NSCs细胞膜被动电生理特性的研究中，发现无论在增殖还是分化条件下，石墨烯都不会影响NSCs及其子代细胞的电容和输入电阻，但是会促使静息膜电位变得更负，这可能是由于石墨烯促进了细胞膜上机械敏感性门控钾离子通道TREK-1的表达。在对NSCs细胞膜主动电生理特性的研究中，通过探究石墨烯对NSCs及其子代细胞动作电位的影响，发现石墨烯可以加速不同发育阶段NSCs细胞膜主动生物电特性的成熟，但是不会影响成熟神经元的离子通道。为了进一步确认生物电特性对新生神经元发育以及成熟的影响，通过对分化21天的神经元的树突棘形态、突触蛋白的表达、突触后电流的记录发现石墨烯可以促进新生神经元形态和突触功能成熟。最后，为了解释导电材料对NSCs的调控机制，基于以上实验以及COMSOL multiphysics建模提出了一个新的假说：导电的石墨烯能够促使NSCs及其子代细胞本身所产生的微电场强度增加、分布变广，从而促进NSCs细胞膜生物电功能的成熟，进而调控NSCs及子代细胞的结构与功能。该假说也提示着外加电场同样可以调控NSCs的行为发生。
　　在第二部分，以石墨烯为神界界面及参考电极，首次在体外建立了基于人工耳蜗的声电刺激体系，该体系可以同时用于多个实验，极大的降低实验成本和时间成本。接着，从南京鼓楼医院选取了50例4-5岁语前聋小孩最后一次进行开机调试的数据，初步确定了声电刺激的脉宽、强度、频率。随后，以人工耳蜗的直接作用靶点螺旋神经元为研究对象，优化该体系使其具有良好的细胞相容性，可用于研究声电刺激对于螺旋神经元和干细胞的调控规律和作用机制。同时还发现长时间刺激螺旋神经元可以促进神经突的生长，这种促进作用可能和生长锥的发育有关。值得注意的是，该体系也可用于包括Ti3C2Tx在内的所有导电组织工程材料。
　　在第三部分，归纳了人工耳蜗-石墨烯声电刺激对NSCs的调控规律。复合频率的高幅度声电刺激不仅具有明显的神经毒性，而且还能降低NSCs的增殖潜能。在探究为什么人工耳蜗-石墨烯声电刺激系体会产生神经毒性的过程中，发现这种毒性作用是刺激时间和刺激幅度依赖的，降低刺激幅度后神经毒性明显减弱，NSCs的增殖能力也得到了部分恢复。进一步的深入探究，发现人工耳蜗-石墨烯声电刺激系体的神经毒性来源于高频声电刺激，单纯的低频刺激不仅不会产生神经毒性，而且还会促进NSCs的增殖。这种促进作用在以Ti3C2Tx为衬底的声电刺激体系中也得到了验证。同时，在人工耳蜗-石墨烯声电刺激对NSCs分化行为的研究中，同样发现复合频率高幅度声电刺激会抑制干细胞分化为神经元的能力，但是单纯的低频刺激不仅可以显著提高神经元的分化效率，而且还能促进新生神经元突触的发育。因此可以通过对基于人工耳蜗的声电刺激体系中频率、幅度、刺激时间单参数或多参数的综合调节调控NSCs的存活、增殖、分化潜能，为在体控制移植后干细胞、新生神经元的数量和质量提供了可能。