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[目 的]舌鳞癌是一种最常见的口腔颌面部恶性肿瘤,其恶性程度较高、侵袭性强、极易复发。舌鳞癌患者常采用放疗、手术及化疗等综合序贯治疗,但目前患者的五年生存率并未显著提高。天然药物蒿甲醚是一种青蒿素的衍生物,能抑制多种恶性肿瘤细胞的生长,具有潜在的抗肿瘤作用,但其抗舌鳞癌作用和分子机制尚不明了。本研究以口腔舌鳞癌细胞为研究对象,在体外分析蒿甲醚对舌鳞癌细胞增殖及凋亡的影响,明确蒿甲醚的抗肿瘤作用,重点关注蒿甲醚对HSP90/AKT的影响以及从miRNA角度来探索蒿甲醚体外抗舌鳞癌的分子机制,为蒿甲醚治疗舌鳞癌提供理论依据和实验基础。[方法](1)CCK8法检测不同浓度蒿甲醚处理前后细胞增殖抑制率。(2)流式细胞仪检测不同浓度蒿甲醚处理前后细胞周期和凋亡率。(3)蛋白免疫印迹实验检测不同浓度蒿甲醚处理前后凋亡相关蛋白表达。(4)实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测蒿甲醚处理前后HSP90α和AKT mRNA和蛋白表达水平的变化。(5)免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)及 Duolink 原位邻位连接技术检测蒿甲醚处理前后HSP90α和AKT蛋白相互作用。(6)通过生物信息学数据库(microRNA.org,TargetScan 和 miRTarBase)对靶向AKT的miRNA进行预测分析并结合文献报道筛选miRNAs,采用实时荧光定量PCR检测蒿甲醚处理前后miRNAs变化,筛选出差异表达的miRNA为miR-29a-3p。(7)生物信息学分析和双荧光素酶报告检测通过生物信息学数据库查询预测miR-29a-3p可结合AKT2-3’ UTR和AKT3-3’UTR,双荧光素酶分析验证。(8)构建稳定敲低miR-29a-3p的舌鳞癌Cal-27细胞株即Cal-27-hsa-miR-29a-3p inhibitor sponge 和阴性对照细胞株即 Cal-27-shNC。0.10 mg/ml 的嵩甲醚处理上述细胞24 h后,以未处理组为对照,采用CCK8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测凋亡率;蛋白免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白表达。(9)所有实验数据均以“均数土标准差”表示,应用统计软件SPSS25.0对实验数据进行统计分析,采用单因素方差分析和student’s-t检验对各组独立样本进行分析,组间两两比较采用LSD-t检验,p<0.05有统计学意义,p<0.01统计学有显著差异。用GraphPad Prism5.0软件绘制统计图。[结 果](1)蒿甲醚能抑制舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞增殖,使Cal-27细胞周期阻滞于G2/M期CCK8法检测各组细胞增殖活力发现蒿甲醚对舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞的增殖活力具有抑制作用,细胞增殖抑制率随蒿甲醚浓度增高而增强,具有浓度依赖性(p<0.01)。流式细胞仪对各组细胞行细胞周期检测结果表明蒿甲醚使Cal-27细胞周期阻滞于G2/M期(p<0.01)。(2)蒿甲醚能诱导舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞凋亡,上调Cal-27细胞cleaved caspase 3表达和下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达流式细胞仪检测发现不同浓度蒿甲醚处理Cal-27和SCC-15细胞组凋亡率明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.01)。免疫印迹法进一步检测凋亡相关蛋白结果发现,与对照组相比,蒿甲醚处理组舌鳞癌Cal-27细胞中Bax和Bad促凋亡蛋白表达量无明显变化(p>0.05)。但蒿甲醚可明显上调cleaved caspase 3的表达和下调Bcl-2的表达(p<0.01)。(3)蒿甲醚能下调舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α的mRNA和蛋白表达qRT-PCR检测发现蒿甲醚能下调舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α的mRNA即HSP90AAlmRNA表达,并呈浓度和时间依赖性。免疫印迹法检测发现HSP90α蛋白的表达趋势与HSP90AA1 mRNA相似。(4)蒿甲醚能下调舌鳞癌Cal-27细胞中AKT和p-AKT蛋白表达qRT-PCR检测发现蒿甲醚对舌鳞癌Cal-27细胞中AKT mRNA表达无明显影响(p>0.05)。而免疫印迹检测发现蒿甲醚能下调Cal-27细胞中AKT和p-AKT蛋白表达(p<0.05)。(5)蒿甲醚能抑制舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α与AKT之间蛋白互作免疫共沉淀检测发现在舌鳞癌Cal-27细胞中HSP90α和AKT存在蛋白互作,蒿甲醚处理后两者互作减弱。进一步采用Duolink原位蛋白邻位连接技术验证也获得相似结果。(6)蒿甲醚能上调舌鳞癌Cal-27细胞中miR-29a-3p表达,进而负性调控AKT3采用生物信息学数据库筛选出可能靶向调控AKT的5个miRNAs,qRT-PCR验证,检测发现蒿甲醚可上调舌鳞癌Cal-27细胞中miR-29a-3p表达。生物信息学分析显示miR-29a-3p可结合AKT2-3’UTR和AKT3-3’UTR。双荧光素酶分析检测发现在293T细胞中,miR-29a-3p与AKT2-3’UTR没有结合;但与AKT3-3’UTR的两个靶点均能结合,进而负性调控AKT3表达水平。(7)miR-29a-3p功能缺失能下调蒿甲醚体外抗舌鳞癌Cal-27细胞作用CCK8法检测发现敲低miR-29a-3p能下调蒿甲醚对舌鳞癌Cal-27细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测发现敲低miR-29a-3p能减弱蒿甲醚对Cal-27细胞凋亡的诱导作用;免疫印迹检测发现敲低miR-29a-3p能减弱蒿甲醚对cleaved caspase 3表达的促进作用、降低蒿甲醚对抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制作用、削弱蒿甲醚对AKT3和p-AKT3表达的下调作用。[结论](1)蒿甲醚能抑制舌鳞癌Cal-27和SCC-15细胞增殖,将Cal-27细胞周期阻滞于G2/M期;蒿甲醚能下调Cal-27细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达和促进Caspase 3活化,诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。(2)蒿甲醚可能通过下调HSP90α、AKT和p-AKT表达,并抑制HSP90α和AKT二者之间蛋白互作;同时,其可能通过上调miR-29a-3p,负性调控AKT3表达,抑制AKT信号通路,发挥抗舌鳞癌作用。