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研究背景:流行病学调查提示,孕期不良因素(如饮酒、药物等)暴露可导致胚胎器官发育不良,子代幼年及成年心血管、免疫及代谢系统疾病易感性增加。本室前期研究证实,孕期咖啡因暴露可抑制胎胸腺发育,导致胎胸腺初始T细胞输出减少,子代成年后免疫功能紊乱及免疫相关疾病(如哮喘,1型糖尿病等)易感性增加。然而,孕期咖啡因暴露如何抑制胎胸腺T细胞输出亟待进一步研究。已知咖啡因可诱导肝星形细胞、骨骼肌细胞等发生自噬,而细胞自噬与胸腺细胞发育密切相关。因此,本研究拟从细胞自噬角度阐明孕期咖啡因暴露对胎胸腺细胞发育的影响及其分子机制。目的:观察孕期咖啡因暴露对胎胸腺细胞发育表型的影响,探讨细胞自噬在胎胸腺细胞发育中的作用,进一步阐明咖啡因调控细胞自噬的分子机制。方法:(1)动物实验观察孕期咖啡因暴露对胎胸腺细胞表型及自噬的影响:受孕小鼠随机分为对照组和咖啡因组,咖啡因组孕鼠于孕9天(gestational day 9,GD9)开始灌胃给予咖啡因(96mg/kg/d,每天给药两次,早晚各一次),持续至生产,正常对照组给予等体积生理盐水。于孕18天(gestational day 18,GD18)剖腹取胎鼠,记录胎鼠体重,收集胎胸腺,计算胎胸腺脏器指数。流式细胞术检测胎胸腺细胞表型并换算各类细胞的绝对计数;透射电镜观察胎胸腺自噬超微结构;RT-PCR检测自噬调控基因(A2AR、PKA、A20)和自噬标志基因(Beclin1、LC3和Atg5)的表达;Western blot检测自噬调控蛋白p-PKA、自噬标志蛋白(Beclin1、LC3和P62)以及胞质中Bcl10的表达。(2)细胞实验研究咖啡因致胸腺细胞自噬及其机制:取出生后3周健康小鼠,无菌环境下建立原代胸腺细胞培养体系,分为正常对照组和咖啡因不同剂量(0.4、4、40和400 μM)组,给药48 h后,CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测细胞活力。选取合适的咖啡因剂量(0.4、4和40 μM),给药48 h行量效实验,流式细胞术检测胸腺细胞表型,Western blot检自噬标志蛋白的表达;选取4 μM咖啡因行时效实验,分别处理胸腺细胞0、24、48及72 h,Western blot检测自噬标志蛋白的表达。根据量效和时效结果,选择合适的给药时间和剂量,进行自噬的调控机制研究。首先,为探究咖啡因是否通过自噬影响胸腺细胞表型,我们使用自噬抑制剂Bafilomycin A1(5nM)与咖啡因共同处理细胞,流式细胞术检测胸腺细胞表型,Western blot检测细胞自噬标志蛋白及Bcl10的表达,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测自噬标志蛋白P62与Bcl 10之间的相互作用。RT-PCR检测A20的mRNA表达。进一步,为观察咖啡因是否通过A2AR诱导胸腺细胞自噬,我们选用A2AR特异性抑制剂SCH 58261(25 μM)与咖啡因分别处理细胞,Western blot检测自噬标志蛋白及p-PKA的表达情况。结果:(1)动物实验:①生长发育指标:与对照组相比,咖啡因组胎胸腺重量和胸腺脏器指数均显著低于对照组(P<0.01,P<0.05)。②胎胸腺细胞表型:双阳性细胞(double positive,DP)和CD4+单阳性(single positive,SP)细胞绝对计数较对照组明显下调(P<0.05),双阴性细胞(doublenegative,DN)及CD8+单阳性细胞绝对计数较对照组未有明显变化。③胎胸腺自噬情况:透射电镜结果提示,与对照组相比,咖啡因组自噬小体增加;RT-PCR结果示,Beclin1和Atg5 mRNA显著上调(P<0.05);Western blot结果显示,LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表达显著增加(P<0.05),P62的表达降低(O<0.05)。④自噬调控通路变化:与对照组相比,咖啡因组p-PKA在胎胸腺中蛋白表达较对照组下降24%,Bcl10显著降低(P<0.05),A20mRNA表达也显著下调(P<0.05)。(2)细胞实验:①细胞活力:0.4～40 μM咖啡因处理呈剂量依赖性地降低胸腺细胞活力(P<0.05)。②咖啡因量效与时效实验结果:量效结果显示,0.4～40 μM咖啡因均可显著降低CD4SP比例(P<0.05),DN、DP和CD8SP比例无明显改变;0.4μM咖啡因对细胞自噬无明显影响,4和40 μM咖啡因可显著上调自噬水平;时效结果显示,咖啡因的促自噬作用呈时间依赖性增加,24 h咖啡因处理对胸腺细胞自噬水平无明显影响,48和72 h咖啡因处理皆显著增加了胸腺细胞自噬水平(P<0.01)。③细胞自噬介导胸腺细胞表型改变:与对照组相比,4μM咖啡因处理48h后,CD4SP和CD8SP比例显著降低(P<0.05),DN和DP比例无明显变化;同时,咖啡因组细胞自噬显著增强(P<0.05),Bcl10表达减少(P<0.05);Co-IP结果示,咖啡因组Bcl10与P62的结合降低32.64%。与咖啡因组相比,添加BafilomycinA1与咖啡因同时处理后,CD4SP比例增加(P<0.05),P62和LC3Ⅱ含量增加(P<0.05);Bcl10的表达也显著增加(P<0.05)。Co-IP结果提示,胞质中以复合物形式与P62结合的Bcl10较咖啡因组增加41.47%。④A2AR介导胸腺细胞自噬:与对照组相比,添加A2AR特异性抑制剂SCH58261后,Beclin1和LC3Ⅱ显著增加(P<0.05),p-PKA表达明显降低(P<0.05);咖啡因组Beclin1、LC3和p-PKA变化趋势与SCH58261处理组一致,且均有显著性差异(P<0.05)。结论:孕期咖啡因暴露可通过抑制胎胸腺中A2AR/PKA信号通路,促进细胞自噬的发生,进而使与P62结合的Bcl10通过细胞自噬的方式被降解,抑制其对A20的转录,致使胎胸腺CD4SP细胞的分化发育受阻,CD4SP细胞输出减少。