疲劳一直以来都是一个让我们熟悉的话题,目前,我们对于疲劳的理解也已经从单纯的躯体疲劳扩展到精神和认知的功能失调。疲劳作为一种非特异的症状不仅存在于许多疾病中(比如多发性硬化,肿瘤,脑卒中,系统性红斑狼疮,缺血性心脏病,重型抑郁等等),并且也可以作为一个独立症状存在于普通人群中,尤其是在受过高等教育的中高级白领人群中更为普遍。在疲劳的状态下,人们的免疫力被严重削弱,从而容易罹患各种感染性疾病;同时疲劳也会增加人们患心血管疾病的风险,比如诱发急性心肌梗塞。因此如果能有效地缓解疲劳将会对改善我们的工作和生活的质量有着极为显著的意义。在本研究中,我们运用蛋白质组学的方法在疲劳大鼠模型中筛选到一个疲劳相关蛋白:Orosomucoid 1 (ORM 1),通过在体外合成该蛋白的纯品以及siRNA序列进行整体实验发现该蛋白具有抗疲劳活性,而大环内酯类抗生素由于能有效地诱导该蛋白的体内合成也具有抗疲劳活性。另外,对红霉素进行结构改造获得的螺缩酮经证实已无抗菌活性,但仍能诱导ORM 1的表达,延长小鼠的游泳时间,从而也具有抗疲劳活性。随后的机制研究发现ORM 1可以通过增加p-AMPK的表达来刺激GLUT4的膜转位,从而动员更多的葡萄糖被转运至肌细胞内来刺激糖原合酶的表达使得机体骨骼肌中的糖原储备增加,最终增强机体的抗疲劳能力。另外,我们收集了100例普通人群和46例慢性疲劳综合症病人的血样检测ORM 1的含量,发现疲劳状态超过半年的人群(包括慢性疲劳患者,特发性慢性疲劳患者和慢性疲劳综合症患者)血样中的ORM 1均显著增加。另外,我们还发现雌性大鼠比雄性大鼠更易疲劳可能与雌激素抑制ORM 1的产生有关。具体实验结果如下:实验一:疲劳大鼠肝脏组织差异表达蛋白的寻找以及验证利用DIGE实验技术平台,比较分析疲劳大鼠和正常大鼠肝脏差异蛋白的表达。结果有11个差异蛋白点得到串联质谱的鉴定。其中,alpha-酸性糖蛋白(alpha-1 acid glycoprotein,ORM 1)在疲劳大鼠肝脏中显著增加。这一结果在随后的Western Blot实验得到验证。实验二:ORM 1与疲劳的关系为了进一步研究血清ORM 1的含量与疲劳之间的关系,我们引入了运动力竭疲劳模型(简称为力竭组)和经典疲劳模型(疲劳组),检测了两组肝脏,骨骼肌和血清中ORM 1的表达。发现在疲劳组大鼠中,其肝脏,血清和骨骼肌中的ORM 1的水平都显著增加,而在力竭组大鼠中只有血清和肌肉中的ORM 1含量增加。此外,为了明确疲劳的严重程度与血清ORM 1的含量之间的联系,我们检测了经典疲劳模型大鼠在疲劳1天,3天,5天,疲劳5天后加休息1天和疲劳后5天加休息3天的血清ORM 1含量,发现随着疲劳程度的逐渐加重,其血清中ORM 1的水平亦相应增高,而当疲劳大鼠经过休息恢复以后,其血清中ORM 1的含量亦逐渐回复到正常水平。实验三:ORM 1在疲劳中的功能研究为了进一步明确ORM 1在疲劳中所发挥的作用究竟是具有某种生物学功能还是仅仅只是一个标志物,我们通过给C57小鼠注射纯品ORM 1,发现小鼠游泳时间显著延长。与此同时,当疲劳的小鼠不能正常产生ORM 1(siRNA in-vivo)时会表现得更易疲劳(与单纯疲劳的小鼠相比,其游泳时间显著缩短。)实验四:大环内酯类抗生素通过诱导ORM 1的表达发挥抗疲劳活性依据文献报导,选用不同剂量的红霉素来诱导小鼠体内ORM 1的表达并同时检测其相应的游泳时间。结果发现,红霉素可以剂量依赖性地上调小鼠血清ORM 1的水平,同时剂量依赖性地延长小鼠的游泳时间。在对红霉素治疗小鼠的同时干扰ORM 1的合成后,红霉素延长小鼠游泳时间的效应则被大大抵消。大环内酯类的其他抗生素例如克拉霉素和阿奇霉素也具有相类似的效果。另外,在对红霉素进行结构修饰后发现,其抗菌活性基团对于其发挥抗疲劳效应不是必须的。实验五:ORM 1抗疲劳的机制研究ORM 1可以上调骨骼肌p-AMPK的表达,促进葡萄糖转运子4(Glucose Transporter 4, GLUT4)从细胞浆转运到细胞膜来发挥葡萄糖的跨膜转移,最终通过活化糖原合酶来增加细胞中的糖原储备。在疲劳组和红霉素组中,ORM 1刺激GLUT 4从胞浆转位到胞膜(膜GLUT 4的表达增加),使得糖原合酶的活性形式非磷酸化的糖原合酶表达增加,从而使得糖原的合成相应增加。这一效应在AMPK-α敲除的小鼠中消失,尽管红霉素依旧能诱导ORM 1的表达增加,但是后续的GLUT 4转位以及最终的糖原储备增加效应已经被明显削弱。实验六ORM 1在人群中的研究我们在人群中通过发放疲劳问卷的方式来对人群的疲劳程度进行分级:对照,轻度疲劳,疲劳,慢性疲劳,特发性慢性疲劳和慢性疲劳综合症(排序从轻到重)。在所选取的100例人群中,有38例被纳入不疲劳组,22例纳入轻度疲劳组,18例纳入疲劳组,9例纳入慢性疲劳组,13例纳入特发性慢性疲劳组(其中有7例血清ORM 1含量高于人群的ORM 1参考值上限:1 mg/ml)。没有个体符合慢性疲劳综合症的诊断。随后我们检测了上述所有个体的血清ORM 1的含量,发现在疲劳状态超过半年以上的慢性疲劳组和特发性慢性疲劳组中其血清ORM 1的水平要显著性地高于对照组。另外,对纳入研究的慢性疲劳综合症的46例患者进行血清ORM 1检测,亦同样发现ORM 1显著性地升高。实验七:疲劳的性别差异与雌激素抑制ORM 1的产生有关我们发现雌性大鼠的游泳时间要显著少于雄性大鼠。而去卵巢的雌性大鼠的游泳时间要显著性地长于假手术组,在对去卵巢大鼠给予雌激素治疗以后,其游泳时间与假手术大鼠组没有差异。随后我们检测了雌雄大鼠在疲劳状态下肝脏ORM 1的含量,发现在同样的疲劳状态下,雌性大鼠所产生的ORM 1要显著性地少于雄性大鼠。在对去卵巢大鼠和假手术组的大鼠肝脏ORM 1的含量进行检测时,发现去卵巢大鼠肝脏能产生更多的ORM 1。随后我们分别测定了雌激素受体α和β敲除的小鼠的游泳时间,发现同野生型相比,在雌激素受体被敲除以后其游泳时间的性别差异消失。提示我们疲劳的性别差异可能与雌激素抑制ORM 1的产生有关。结论:1. ORM 1是一种内源性的抗疲劳蛋白;2. ORM 1可能作为慢性疲劳综合症的诊断标志物;3.疲劳的性别差异可能与疲劳时雌激素对ORM 1的产生抑制有关。