钙受体蛋白(CAS)参与氮肥调控拟南芥开花时间机制研究

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钙受体蛋白(CAS)定位于植物叶绿体类囊体膜上,前期研究发现CAS基因功能的缺失会引起拟南芥叶片衰老及开花时间提前,这与植物缺氮表现的叶片黄化及开花提前的生理现象比较类似,CAS是否参与拟南芥根系氮肥的吸收、转运及利用,鲜有文献报道。为揭示CAS如何参与植物氮素调节和开花过程,本论文以拟南芥为材料,通过表型观察、生理及分子生物学等手段进行验证。主要结论如下:1.利用MEGA-X软件对40多种植物体内CAS进行系统进化树分析表明,CAS是植物体内一种普遍存在的钙受体蛋白,多数植物种仅有一个CAS类似蛋白,但对于一些阴生植物和日中性植物有2-3个类似的蛋白。鉴于CAS是一个受光强调控的磷酸化蛋白,推测植物体内的CAS可能与其光适应性有密切关系。2.下胚轴伸长和向光性试验中,在红光和黑暗条件下,野生型拟南芥(WT)和CAS突变体(CASas)表型无显著差异,在蓝光条件下,CASas下胚轴比WT长3.3 mm,与蓝光受体隐花色素突变体cry1类似,在强蓝光条件下(100μmol·m-2·s-1左右)CASas向光性弱于WT,结果表明CASas响应蓝光信号;基因表达试验结果表明,(1)CASas中HY5基因表达量显著低于WT;(2)在蓝光和红光条件下,CASas突变体中CRYPTOCHROME CIRCADIAN REGULATOR 1(CRY1)基因表达量低,比WT低40%,黑暗条件下二者无明显差异;(3)长日照(LD)和短日照(SD)条件下,CASas中CRYPTOCHROME CIRCADIAN REGULATOR 2(CRY2)基因表达量低,LD条件下相对于WT低40%,在SD条件下低70%。CRY1和CRY2的蛋白表达试验与基因表达试验结果相吻合。可知,CAS参与植物蓝光信号途径。3.低钙(0.1 mM)、正常钙(1 mM)和高钙(10 mM)处理下,开花周期基因转录表达结果为三种钙浓度下CASas的FLOWERING LOCUS C(FLC)、FLOWERING LOCUS T(FT)和LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)的表达量高于WT。CASas中FLC在低钙、正常钙和高钙处理下表达量最低的时间分别为22时、6时和14时,表达量最高均为2时。低钙和高钙处理下CASas和WT中FT的表达量低于正常钙,仅为正常钙处理的50%。高钙条件下CASas中的LHY在10时表达量最多,相比于低钙和正常钙延后四个小时。以上结果表明CAS及其偶联的钙信号参与植物开花调控。钙氮开花试验表明,低氮(0.2 mM)和正常氮(2 mM)处理下WT早花,随着钙素的增加,CASas和WT的开花时间越来越接近。在高氮处理(20 mM)下,CASas比WT更早开花且对钙素的增加不再做出反应,推测CAS和钙参与氮素调控植物开花过程。4.表型观察试验中,CASas出现早花、早衰、莲座叶片数少和叶片黄化性状,LD条件下CASas的莲座叶片数比WT少5片,开花时间比WT早7d。在SD条件下,CASas的莲座叶片数比WT少25片,开花时间比WT早40d。LD下,WT光合参数显著高于CASas,WT的SPAD和光合速率分别为25和5.95μmol·m~2·s-1,而CASas的SPAD和光合速率分别为18和3.90μmol·m~2·s-1,推测CAS影响植物氮代谢。5.荧光定量PCR试验证明NITRATE TRANSPORTER 1.5(NRT1.5)和NITRATE TRANSPORTER 2.5(NRT2.5)在CASas中转录水平显著低于WT,且CASas中的氮含量(81.3 mg/kg)显著低于WT(110.9 mg/kg),结果表明CAS参与了植物氮元素的吸收和转运。
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