论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV2）可引起猪的多种疾病综合征,并且造成免疫系统严重受损,是威胁我国生猪健康养殖的重要病原之一。猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3,PCV3）与PCV2临床症状相似,感染后表现为生殖系统障碍、全身炎症和腹泻等临床症状,目前尚无有效的商品化疫苗。鉴于我国各地养殖场PCV2和PCV3阳性率常年居高不下,且长期处于混合感染情况下,开发一种快速、准确的鉴别诊断技术对于病毒的预防、控制和净化非常重要。因此,本研究旨在建立一种猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）的双重实时荧光定量PCR方法,并在临床诊断上进行初步应用。主要研究内容和结果如下:1.PCV2和PCV3双重实时荧光定量PCR方法的建立本研究于2020年6月26日从NCBI Gen Bank数据库检索获得PCV2全基因组序列共计2764条,PCV3全基因组序列共计453条。分别设计两对引物和探针用于扩增PCV2和PCV3的Rep基因的保守区域。构建p MD18T-PCV2和p MD18T-PCV3重组质粒作为本方法的阳性质粒标准品后,通过调整反应体系中的引物浓度、探针浓度和反应程序的退火时间、退火温度,完成反应体系和反应程序的优化。以养殖场内共感染率高且临床症状相似的其他传染病原为模板进行双重荧光定量检测方法的特异性试验,结果显示仅PCV2和PCV3模板出现特异性扩增,证明本方法特异性强。以10倍梯度浓度稀释后的阳性标准质粒为模板进行扩增,将扩增结果绘制成标准曲线。灵敏度试验结果显示,本方法PCV2和PCV3的灵敏度最低可达到10拷贝/反应的和50拷贝/反应,证明本方法灵敏性高。建立的PCV2和PCV3的标准曲线的线性关系良好,扩增效率（E%）分别为98.75%和99.54%。同一批次内3组重复的稳定性试验和5个不同批次之间的重复性试验的Ct值的相对标准偏差（RSD）均小于1%,证明本方法稳定性和重复性良好。选取应用本方法检测临床样品中的30份PCV2阳性核酸和30份阴性核酸作为同一测试模板,与国家标准猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法（GB/T35901-2018）进行符合率试验,结果显示阳性样品符合率100%,阴性样品符合率100%。应用本方法检测临床样品中的选取30份PCV3阳性核酸送至测序公司进行基因组测序,将测序结果经NCBI-BLAST进行核苷酸序列比对同源性达99.5%以上,证明PCV3的阳性符合率为100%。2.湖北省某种猪场内猪圆环病毒2型与3型病原学检测利用本研究建立的PCV2和PCV3双重实时荧光定量检测方法对湖北省某地方种猪场内PCV2和PCV3的流行状况进行分析。于2021年上半年采集106份临床剖检病料。双重荧光定量检测结果显示,该猪场内PCV2的阳性率为50.0%（53/106）,PCV3由阳性率为11.3%（12/106）,共感染率为8.5%（9/106）。所得阳性核酸经扩增后基因测序进行确认。检测结果证明该场确实存在PCV2和PCV3的混合感染,而且PCV2感染情况比较严重,需要及时对场内病毒采取控制措施。3.湖北省某种猪场内猪圆环病毒2型与3型测序与遗传进化分析将湖北省某种猪场PCV2和PCV3病原学检测为阳性的核酸进行全基因组测序。将测序结果与NCBI Gen Bank中已上传的PCV2和PCV3不同亚型毒株的核苷酸序列进行比对,通过测序结果构建系统发育进化树和同源性矩阵,并再此基础上进行全基因组特征、遗传进化分析与Cap蛋白氨基酸序列比对分析。结果证明,本研究鉴定的PCV2分离株属于PCV2b型,PCV3分离株属于PCV3a-1型。本研究测序的毒株（PCV2-HB/XN/2021）与2001年～2021年以来内外不同亚群代表参考毒株的核苷酸同源性为83.5%～99.2%。本研究的测序毒株（PCV3-HB/XN/2021）与2016年～2021年国内外不同来源的PCV3参考毒株核苷酸同源性较高,为98.1%～99.5%。PCV2和PCV3 Cap蛋白氨基酸序列比对结果显示,本研究测序PCV2毒株的59位氨基酸突变为K与PCV2d和PCV2h相同,而其他PCV2b中为R/A。除此特殊位点外,本研究测序的PCV2毒株与其他6种分型毒株的Cap蛋白的差异氨基酸与2009年在中国分离发现的Porcine circovirus 2 strain 09GD株完全一致。本研究鉴定的PCV3毒株除了24位和27位以外还有位于预测的B细胞表位上的第104位,其苯丙氨酸（F）突变为酪氨酸（Y）。以及156位的苏氨酸（T）,区别于其他亚型156位的丝氨酸（S）。综上所述,本研究所建立的PCV2与PCV3双重实时荧光定量PCR检测方法能够灵敏且特异地检测和区分PCV2和PCV3,为兽医临床上该病的诊断和流行病学调查提供了检测技术支持。