棉花是主要的天然纤维来源和重要的经济作物,基因编辑技术能够精准高效的在棉花中对候选基因进行功能验证,而再生苗获得需要成熟、稳定、高效的体细胞再生体系,但棉花遗传转化中普遍存在的基因型限制、发育不同步和遗传转化周期长等瓶颈问题严重制约着转基因苗的获得。为了解析调控棉花体细胞胚胎发生的分子机制,从陆地棉体胚发生转录组数据库中发现了一个在体胚发生阶段优势表达的基因GhMYB44,本研究对GhMYB44在棉花体细胞胚胎发生中的功能进行了研究,主要研究结果如下:1.GhMYB44调控棉花体细胞胚胎发生根据棉花体胚发生过程的转录组数据库分析结果,结合q RT-PCR实验,发现一个在体胚发生阶段优势表达的基因GhMYB44。构建了过表达载体和GhMYB44-SRDX融合表达的嵌合抑制子载体转化棉花。发现过表达GhMYB44基因抑制愈伤组织的起始和增殖,促进愈伤组织向胚性愈伤组织的分化。GhMYB44-SRDX嵌合抑制子材料与对照材料的愈伤组织增值率差别不大,但是抑制子材料再分化为胚性愈伤组织的时间推后。2.GhMYB44影响棉花体细胞胚胎发生过程中生长素的积累为了研究GhMYB44是否影响棉花体胚发生中内源生长素的含量变化,对不同转基因株系和对照株系诱导后的7d、15d、35d、60d生长素含量进行了测定。结果显示超表达材料在愈伤组织诱导阶段生长素含量均高于对照材料和嵌合抑制子材料。为了更加直观研究GhMYB44对生长素积累的影响,将GhMYB44转基因株系和对照株系与DR5::GFP株系进行杂交,发现在超表达GhMYB44株系外植体的切段顶端荧光信号强,生长素分布极性明显,而在对照F1材料的外植体中只看到少量的GFP荧光,表明GhMYB44超表达材料的愈伤增殖过程中有大量生长素积累,生长素含量高的愈伤细胞更容易分化成胚性愈伤细胞。3.GhMYB44互作蛋白的筛选和功能验证为了进一步研究陆地棉GhMYB44调控体胚发生的分子机理,挖掘其在体胚再生过程中的互作蛋白至关重要。利用棉花体胚发生c DNA文库,通过酵母双杂交筛选到一个与GhMYB44互作的蛋白靶标Gh PYL8。利用蛋白互作经典检测技术Y2H和Bi FC证实GhMYB44与Gh PYL8蛋白互作。并对Gh PYL8在棉花体胚发生过程中的表达模式进行了分析,发现该基因在愈伤组织诱导初期表达水平逐渐下降,在胚性组织中表达量最高,而后表达量逐渐下降,说明Gh PYL8与胚性愈伤组织的分化密切相关。且该基因在高分化率材料的愈伤组织向胚性组织转变这一关键阶段表达量逐渐升高。进一步对Gh PYL8在体胚发生过程中的功能进行了验证,结果显示过表达Gh PYL8基因能够快速诱导愈伤组织分化为胚性愈伤组织,推测Gh PYL8和GhMYB44相互作用后增强了GhMYB44蛋白的转录调节活性。遗传和生化试验结果均说明Gh PYL8和GhMYB44互作能够调控愈伤细胞的形态变化,进而调控愈伤增殖和胚性愈伤的产生。4.GhMYB44下游靶标基因的筛选和功能验证根据DAP-seq富集区间的Motif,结合本实验室已有研究结果,定位到GhMYB44与Gh LBD18启动子结合的序列区间,该区间包含MYB结合基序（TAACC）。在烟草中开展Effector-Reporter报告实验,实验结果验证了GhMYB44对Gh LBD18的抑制。进一步分析了GhMYB44及靶基因Gh LBD18在愈伤组织起始脱分化阶段的表达模式,发现在愈伤组织起始阶段GhMYB44的表达模式与Gh LBD18相反,说明GhMYB44可能负调控Gh LBD18的转录。基因功能验证结果显示过表达Gh LBD18材料的表型与GhMYB44相反,能够显著促进棉花愈伤组织的起始和增殖,且不易分化为胚性愈伤组织。结合分子水平证据,推测GhMYB44直接结合Gh LBD18的启动子从而抑制愈伤组织的增殖和分化。