新城疫（Newcastle disease,ND）是新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一类传染性强的禽类疾病,临床以高热、呼吸困难、黏膜出血等为主要特点。NDV的流行对全球的家禽业构成严重威胁,并造成重大经济损失。因此疫苗接种和抗体水平监测成为了防控NDV的关键。血凝素-神经氨酸酶（HN）糖蛋白是主要保护性抗原之一,其产生的抗体能够中和NDV。因此HN蛋白作为靶抗原,已在多种系统中表达。水稻表达系统能够对外源蛋白进行翻译后修饰,使外源蛋白的结构与天然蛋白基本接近,是外源蛋白比较理想的真核表达系统。本研究利用水稻系统成功表达HN蛋白,通过SP阳离子层析和凝胶过滤层析获得高纯度的HN蛋白,然后利用HN蛋白免疫小鼠后,采用间接ELISA与IPMA方法筛选得到重组HN蛋白的单克隆抗体,最后以胶体金标记HN重组蛋白,利用HN单克隆抗体和兔抗鸡多抗建立了NDV半定量抗体试纸检测方法。主要试验内容及结果如下:1.重组HN蛋白的表达与纯化本研究通过EcoRⅠ和Hind III双酶切重组质粒pUC57-HN和中间载体p MP3（包含有启动子、信号肽和终止子）,HN基因连接到p MP3。然后利用Eco RⅠ和HindⅢ双酶切pMP3-HN1（包含有启动子、信号肽和终止子）和植物载体p CAMBIA1300,HN基因成功连接到p CAMBIA1300,形成重组质粒p CAMBIA1300-HN1并转入农杆菌EHA105。重组质粒p CAMBIA1300-HN1通过农杆菌介导法转入水稻愈伤组织。经PCR鉴定,HN基因已插入到水稻基因组中。通过Western-blot鉴定,重组HN蛋白在水稻细胞中成功地表达。然后通过SP阳离子填料和凝胶过滤层析纯化重组HN蛋白,SDS-PAGE结果显示,HN蛋白纯度高达90%以上。Western-blot结果表明,HN重组蛋白与单克隆抗体的反应性良好。2.单克隆抗体的筛选及鉴定为获得NDV HN蛋白的单克隆抗体,利用重组HN蛋白与弗氏佐剂混合乳化免疫小鼠,通过间接ELISA方法筛选出10株单克隆抗体,然后以ELISA抗体阳性的杂交瘤细胞上清利用IPMA的方法最终筛选获得4株单克隆抗体,分别命名为4E6B7、9D5F9、9D5F10、9D5E12。Western-blot结果表明,4株单克隆抗体与HN重组蛋白的反应性良好,其中9D5E12的ELISA效价为1:40960。亚型结果显示,4株单克隆抗体均属于Ig G1亚类且轻链均为κ链。3.NDV抗体半定量试纸条检测方法的建立为建立NDV抗体半定量胶体金试纸检测方法,根据国家制定的新城疫HI试验诊断技术标准（HI≥4log2,检测的抗体为阳性）,利用胶体金标记HN蛋白,制备一种NDV抗体快速检测试纸。实验表明,试纸与H5N1、H9N2、IBD和MD的病毒阳性血清无交叉反应,且试纸对新城疫标准阳性血清的敏感性达到1:102400。NDV抗体试纸与和HI试验分别检测308份临床血清,其结果显示,它们符合率为97.08%,Kappa值为0.942。综上所述,本研究利用胶体金标记重组HN蛋白研制了一种简单、快速、灵敏度高、特异性强的半定量免疫层析试纸。该试纸可初步应用于新城疫疫苗的免疫评价。综上所述,本研究成功获得了水稻源HN蛋白,经SP阳离子填料和分子筛纯化,蛋白纯度达90%以上,并获得4株具有良好反应原性的单克隆抗体,最后利用胶体金标记HN重组蛋白建立了一种NDV抗体半定量检测方法。