目的：多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是以骨髓中浆细胞恶性克隆性增生为主要特征的血液系统肿瘤，化疗为主要治疗手段。硼替佐米（Bortezomib，BTZ）作为MM患者一线治疗中的基础药物，其疗效已经得到广泛认可。然而，仍有近30%的患者对硼替佐米治疗无效，37~44%的患者在治疗过程中因出现严重不良反应被迫停药。因此，迫切需要高效能、低毒性或能够增强硼替佐米抗骨髓瘤作用的化学药物出现。去甲斑蝥素（Norcantharidine，NCTD）是斑蝥素（一种传统抗肿瘤中药）的去甲基衍生物，不仅保留了斑蝥素原有的抗肿瘤活性，同时使其对肾脏的毒性刺激作用大大降低，得到了许多研究者的认可。我们的前期工作已经证实，NCTD在体外可通过调节NF-κB通路及下游信号分子的表达来诱导U266细胞凋亡，并起到MM细胞对硼替佐米的化疗增敏作用。本实验通过建立人骨髓瘤动物模型，进一步验证NCTD在体内的抗骨髓瘤效应及增强硼替佐米抗骨髓瘤效应的机制，为临床应用NCTD治疗或辅助治疗MM提供更确切的理论依据。方法：1NCTD急性毒性试验：50只健康昆明小鼠随机分成5组。首先通过进行预试验找出NCTD的最大及最小致死剂量，分别为250mg/kg及102.4mg/kg，之后各组剂量用0.9%氯化钠以1:0.8比例依次稀释，按0.2ml/10g体重分别给各组小鼠一次性腹腔注射给药。观察并记录不同NCTD给药剂量下各组小鼠的死亡分布情况，按改良寇氏法计算NCTD的半数致死剂量LD50。2建立MM移植瘤裸鼠模型：32只BALB/C裸鼠，每只肩胛部皮下注射2×106U266细胞，待瘤体体积生长到约100mm3左右，随机分成4组。分别腹腔注射下列药物：（1）对照组：生理盐水100μL/10g，3次/周，连续4周；（2）NCTD组：以接近或略低于1/5半数致死量的NCTD（20mg/kg），3次/周，连续4周；（3）BTZ组：BTZ0.25mg/kg，1次/周，连续4周；（4）联合用药组：NCTD，20mg/kg，3次/周+BTZ，0.25mg/kg，1次/周，连续4周。给药后每周2次对裸鼠瘤体体积进行跟踪观测。于末次给药4小时后以颈椎脱位法将裸鼠处死，剥离移植瘤标本，进行免疫组化及其他后续实验。3病理检查及凋亡、免疫组化检测：移植瘤标本以石蜡包埋并切片至5μm厚，HE染色后光镜下观察移植瘤组织细胞结构，并分别应用原位末端标记（TUNEL）技术及免疫组化方法检测移植瘤组织的细胞凋亡率及PCNA、NF-κB P65的表达量。结果：1NCTD半数致死剂量LD50：根据急性毒性试验结果，各组小鼠死亡率之和Σp=1.0+0.9+0.7+0.6+0.2=3.4，相邻两组剂量对数值之差i=lg250/200=lg1.25=0.1，最大剂量对数值Xm=lg250=2.4，代入寇氏法公式LD50=log-1[Xm–i (Σp–0.5)]=128mg/kg。2各组裸鼠瘤体生长情况：各组小鼠移植瘤体积在用药前无差异(P>0.05)。给药后观察4周，对照组小鼠瘤体生长迅速，肿瘤表面血管丰富，部分出现中心坏死，NCTD及BTZ组肿瘤体积明显小于对照组（P＜0.05），两组的抑瘤率分别为31.83%、36.32%，而以两药联合组的瘤体最小，抑瘤率达64.49%，与BTZ单药组对比，存在显著性差异（P＜0.05）。3各组裸鼠一般状况及生化指标比较：整个治疗过程中，各组小鼠均没有明显的惊恐、不安或拒食等现象，而由于瘤体较大，对照组小鼠出现活动受限。4周后对小鼠的生化指标进行检测，各组小鼠均未出现明显的肾功能损害，血肌酐平均水平均＜0.5mg/dL，比较各组谷丙转氨酶水平，P>0.05，无显著性差异。4TUNEL检测各组移植瘤组织细胞凋亡：各治疗组均可见明显的凋亡细胞，其中以两药联合组最为显著，凋亡细胞核多呈固缩状态、经DAB显色后为深棕色，而对照组中的凋亡细胞并不明显；高倍镜下计数，BTZ、NCTD组的细胞凋亡率分别为29.91%、42.06%，而对照组仅为14.95%，存在显著性差异（P <0.05）；联合用药组的细胞凋亡率为81.80%，与BTZ单药组比较，有统计学意义（P <0.05）。5细胞增殖核抗原PCNA在各组移植瘤组织中的表达情况：作为评价细胞增殖状态的一项常用指标，其阳性表达位于细胞核，棕黄色为阳性反应细胞。本试验中免疫组化结果显示，对照组骨髓瘤细胞增殖极度活跃，其PCNA的阳性表达率高达（89.91±13.59）%，BTZ组与NCTD组的阳性表达率则分别为（71.85±8.93）%和（58.39±9.43）%，明显低于对照组（P<0.05）；而联合用药组PCNA的表达率仅为（11.61±2.94）%，其瘤细胞增殖活性更显著低于BTZ单药组，差异有统计学意义（P <0.05）。6NF-κB P65在各组移植瘤组织中的表达：免疫组化结果显示，棕黄色为NF-κB P65的阳性表达反应，多位于细胞浆。本试验中对照组NF-κBP65的阳性表达率高达（85.23±16.62）%，而BTZ与NCTD的阳性表达率分别为（71.51±9.86）%和（64.80±11.73）%，明显低于对照组（P <0.05）；而联合用药组的阳性表达率仅为（11.95±3.13）%，与BTZ单药组比较，差异具有显著性（P <0.05）。结论：1NCTD能够在体内抑制骨髓瘤细胞的增殖，诱导其凋亡；2NCTD在体内能够增强硼替佐米的抗骨髓瘤细胞增殖及促进凋亡作用；3与体外作用机制相同，NCTD在体内通过抑制NF-κB/IκBα途径，来增强硼替佐米的抗骨髓瘤效应。