研究背景腭裂（Cleft Palates）代表了一类普遍不致命的具有复杂病因、遗传异质性的出生缺陷疾病。它影响了患者的吞咽、语音功能及日后牙齿的萌出和排列。国外新生儿腭裂发生率为0.8‰～1‰，而我国新生儿腭裂发生率高达1.82‰，严重影响人口的优生优育，我国国民身体素质。腭裂的发病原因较为复杂，在腭发育过程，中多种遗传因素及环境因素均可导致腭裂的发生。其中遗传因素对该病的影响作用大约是20～50％。最新研究发现，人Titf-2基因纯合突变，可导致甲状腺发育不全面及腭裂。Titf-2^-／-小鼠表现为腭裂。说明Titf-2基因与腭裂的发生有十分密切的关系。Titf-2基因是甲状腺转录因子-2（thyroid transcription factor-2，TTF-2）的编码基因，定位于小鼠4C2，定位于人9q22。然而，正常情况下，Titf-2基因编码的蛋白TTF-2仅在小鼠胚胎的8-8.5d到13.5d在颅咽内胚层有短暂表达。同时国外Titf-2^-／-腭裂小鼠是通过敲除Titf-2基因，使TTF-2蛋白突变，失去与DNA的结合能力和转录功能，从而降低了TTF-2蛋白表达导致腭裂。但Titf-2基因在腭裂发生中的作用机理仍不清楚。因此本研究设想建立Titf-2转基因小鼠腭裂模型，探讨Titf-2基因在腭裂发生中的作用机理，为进一步研究腭裂的发生治疗、转归提供一种新的研究手段提供和基础研究资料。研究方法体外重组构建Titf-2质粒采用显微注射法，将Titf-2基因注射入小鼠受精卵雄性原核，在体外发育到2细胞胚胎，再将它们回输到假孕母鼠的输卵管中，建立Titf-2转基因小鼠腭裂模型。具体方法如下：1．探索小鼠受精卵雄性原核最佳注射时间（1）采用孕马血清促性腺激素（pregnant mare’s serum gonadotropin PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin HCG）对6周龄雌性小鼠诱导超排卵。（2）在不同时间点获取受精卵，观察受精卵的发育状态，选择最佳受精卵原核注射时间。2．建立Titf-2转基因小鼠腭裂模型（1）采用大肠杆菌扩增Titf-2基因。（2）采用酶切和DNA回收法获得显微注射用Titf-2基因。（3）将已结扎雄鼠与雌鼠交配，制备假孕母鼠。（4）将Titf-2基因注入受精卵原核，体外发育为2细胞胚胎。（5）将2细胞胚胎移植入假孕母鼠输卵管。（6）利用电子显微镜观察不同胎龄鼠腭部的发育。3．Titf-2转基因小鼠腭裂模型鉴定分析采用酶联聚合反应（PCR）和DNA印迹法（Southern Blot）鉴定转基因小鼠基因组DNA中Titf-2基因的整合率。结果1．注射HCG后18～27h，受精卵出现雄性原核的数量和百分率随时间延长而增加；注射HCG后25～27h受精卵出现雄性原核最多，并且受精卵的雄性原核大而清晰，比例最高；注射HCG后28h后受精卵出现雄性原核的数量减少，百分率也减少。2．注射HCG后18～27h，受精卵雄性原核的质量随时间延长而不断增高；注射HCG后24～27h，受精卵的雄性原核较最大，轮廓最清晰：注射HCG后28h后，受精卵的雄性原核质量下降。3．采用显微注射法，共对982枚受精卵注射Titf-2基因，其中580枚发育为2细胞胚胎，存活率约60％。4．将2细胞胚胎移植入20只假孕母鼠输卵管中，其中16只怀孕，假孕母鼠怀孕率为80％。5．获得第1代（F1）代胎鼠41只（2只出现腭裂），F1代出生小鼠3只（均出现腭裂）生后24～48h死亡。6．胚龄15d，正常胎鼠腭突开始融合，转基因胎鼠腭突不融合。7．PCR鉴定分析41只F1代胎鼠，发现12只Titf-2转基因阳性胎鼠，PCR鉴定分析41只F1代出生小鼠，发现3只均为Titf-2转基因阳性小鼠。Southern Blot分析仅有6只Titf-2转基因阳性小鼠（3只胎鼠，3只出生小鼠）。Titf-2目的基因整合率约为14％（6／44）。结论1．Titf-2基因持续表达能致小鼠腭裂2．受精卵雄性原核最佳注射时间为注射HCG后25～27h。3．胚龄15d，正常胎鼠腭突开始融合，转基因胎鼠腭突不融合。4．在本研究中，Titf-2目的基因整合率约为14％。5．PCR检测与Southern blot检测方法相结合，降低Titf-2目的基因整合率假阳性。