肿瘤干细胞在肿瘤的发生和发展中起着决定性作用。但迄今小细胞肺癌中癌干细胞的存在仍缺乏直接证据。本文旨在探索小细胞肺癌细胞系H446中是否存在干细胞。研究目的：1.探讨小细胞肺癌细胞系H446体外无血清培养肿瘤细胞球的方法；2.证明肿瘤细胞球富集了干细胞样细胞,阐明小细胞肺癌中存在癌干细胞。研究方法：1.利用干细胞无血清培养技术,观察H446细胞在下述不同培养条件下肿瘤细胞球的生长情况,(1)接种于超低吸附及非超低吸附培养板,(2)调整细胞密度至1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL和1×107/mL,(3)采用针头吹打法和移液器吹打法将肿瘤细胞球制成单细胞悬液,以探明肿瘤细胞球形成的最佳条件。2.无血清培养成功获得肿瘤细胞球后,首先利用细胞示踪实验证明了肿瘤球的克隆源性,然后采用体外球形成实验、体内裸鼠成瘤实验、有限稀释实验、体外分化实验和细胞毒性实验证明肿瘤细胞球富集了干细胞样细胞。3.采用流式细胞计量术、免疫荧光染色和激光共聚焦照相检测肿瘤细胞球内细胞和贴壁H446细胞中uPAR、CD133、CD90、CD56、Cytokeratin、CD44、AnnexinsⅡ、EGFR、CD24、CEA、Nestin、CD34和MDR1的表达情况,以了解肿瘤球细胞所富集的分子表型。结果：1.影响肿瘤细胞球形成的有关因素不同类型培养板、细胞接种密度和吹打方法对肿瘤细胞球形成及增殖的影响：(1)超低吸附培养板第2天形成明显肿瘤细胞球,非超低吸附培养板第10天出现肿瘤细胞球。(2)1×106/mL组每个高倍视野下约有7个肿瘤细胞球,每个细胞球约由几十个甚至上百个细胞组成。(3)针头吹打法传代后肿瘤细胞球活性和增殖能力明显优于移液器吹打法。2.肿瘤细胞球的生成和特点(1)肿瘤细胞球的形态特点：将处于对数生长期的贴壁H446细胞接种到无血清培养基内,经过4-6天培养后,观察到有肿瘤细胞球形成,细胞球呈球形或者近似球形,悬浮状生长；肿瘤球直径范围50～300um,大多数球的直径为120um；肿瘤球直径50um对应所含细胞数约为30个,直径为300um细胞数约为400多个,绝大多数肿瘤球细胞数目为250个左右；肿瘤细胞球内细胞表面光滑,细胞间紧密相贴,不易吹打成单细胞；细胞形态均一,小圆形,折旋光性良好。(2)肿瘤细胞球的单克隆性：为了鉴别肿瘤细胞球是源于单细胞克隆还是细胞聚集,我们进行了细胞示踪实验。该实验通过收集肿瘤球制成单细胞悬液,分出两管分表标记A管和B管并分别加入两种不同的荧光染料,37℃作用15-45分钟后A管与B管细胞等量混匀后继续无血清培养。第三天显微镜下观察发现大部分肿瘤细胞球只染有一种荧光素,提示它们为单细胞克隆来源。(3)肿瘤细胞球的连续传代和球形成率：肿瘤细胞球具有自我更新能力,可以连续传代40次以上。为了检测球形成率我们进行肿瘤球形成实验,贴壁H446细胞以103个/ml密度接种,结果显示19.50%±0.22%(n=5)的贴壁细胞形成了第一代肿瘤球,第一代肿瘤细胞球制成单细胞悬液接种后,形成了第二代肿瘤细胞球(30.00%±1.00%,n=5)及第三代肿瘤细胞球(49.02%±1.50%,n=5,源于第二代肿瘤细胞球)。第二、三代球形成率与第一代比较有统计学意义(p<0.05),第三代与第二代球形成率之间差别也有统计学意义(p<0.05)。3.有限稀释实验结果收集第三代肿瘤细胞球,消化成单细胞悬液后行有限稀释实验,2～3周后可见来自单个细胞的新肿瘤细胞球形成,克隆形成率为77.00%±1.00%；而接种未成球贴壁细胞H446的孔内,克隆形成率为17.67%±1.53%,差别具有统计学意义(p<0.001)。此外,还发现单细胞克隆来源的肿瘤细胞球可以体外连续传代40次以上4.免疫荧光染色及流式细胞术结果肿瘤球中uPAR、CD133和CD90的表达均比贴壁细胞高,约有90%的肿瘤球细胞表达uPAR,而在贴壁细胞中仅有20%细胞表达uPAR；肿瘤球中CD133和CD90阳性细胞百分比均低于10%。肿瘤球中分化标志物CD56和Cytokeratin的表达均比贴壁细胞低。肿瘤球和贴壁细胞中几乎所有细胞都表达CD44、AnnexinsⅡ和EGFR,而两者均有极少量细胞表达CD24。癌胚抗原CEA、Nestin、CD34和MDR1在肿瘤球细胞和贴壁细胞中均未检测到。5.体外分化实验结果将第三代肿瘤细胞球置于含有10%血清的分化培养基中,可见细胞球迅速贴壁,呈梭形生长,细胞形态呈现明显的异质性。对分化细胞进行免疫化学染色结果显示：分化细胞失表达uPAR和CD133,高表达CD56和Cytokeratin。6.药物抵抗实验及SP分析结果MTT结果显示：顺铂(CDDP)作用72小时后,肿瘤球内细胞生存率为91.60%±2.30%,贴壁H446细胞细胞生存率为38.80%±1.92%(n=5,p<0.001)；依托泊苷(VP16)作用72小时后,肿瘤球内细胞生存率为91.00%±4.12%,贴壁H446细胞细胞生存率为51.20%±1.92%(n=5,p<0.001)。SP流式分析结果为：肿瘤球和贴壁H446细胞内含SP细胞分别为1.35%±0.03%和0.14%±0.02%(n=5,p<0.01)。7.裸鼠成瘤实验结果1×10个肿瘤球细胞即可在裸鼠皮下成瘤,而至少1×106个贴壁细胞才能致瘤。移植瘤组织的免疫组化分析结果显示移植瘤表达分化标志物CD56、Chromogranin A和Cytokeratin。结论：1.肿瘤球富集了干细胞样细胞,具有克隆源性、自我更新性、分化潜能、无限增殖能力和致瘤性,揭示小细胞肺癌细胞系中存在干细胞。2.肿瘤球主要由未分化细胞组成。大部分细胞表达uPAR。与贴壁细胞比较,肿瘤球明显富集了uPAR阳性亚群。3.肿瘤球细胞比贴壁H446细胞具有更强的药物抵抗能力,肿瘤球内SP细胞明显高于贴壁细胞,直接和间接证明了肿瘤球富集了药物抵抗细胞。4.体外无血清培养成功获得了肿瘤细胞球。优化实验显示超低吸附培养板、1×106/mL密度接种和针头吹打法可有效分离肿瘤细胞球。综上所述,小细胞肺癌细胞系H446中存在具有干细胞特性的球形成细胞。肿瘤球明显富集了uPAR阳性亚群。