钙离子载体在树突状细胞诱导分化中的作用及其信号机制

来源 :第一军医大学 南方医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:a86406186
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树突状细胞(dendriticcells,DC)是目前所知的功能最强的、唯一能激活初始(naive)T细胞的专职抗原呈递细胞(antigenpresentingcell,APC),在抗原的加工提呈、抗原识别及T细胞的激活中发挥着重要的作用。因此,DC在免疫应答及其机制的研究和肿瘤及病毒感染等的免疫治疗中处于极重要地位。在体外,单核细胞(monocytes,Mo)、CD34+造血干细胞(haemopoieticprogenitorcells,HPC)及某些髓系白血病细胞可以被多种细胞因子诱导而获得DC的某些免疫表型和功能,并建立了组合性细胞因子(如GM-CSF、IL-4、TNF-α和SCF等)体外扩增培养DC的方法。该课题先对常规的组合性细胞因子诱导DC的表面标志与功能进行了研究,在此基础上,探索了钙离子载体在诱导Mo、HPC及急性白血病细胞向DC分化中的作用及其信号机制。 成熟DC除了具有典型树突状细胞的形态外,还必须特征性高表达与抗原提呈有关的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子,高水平表达多种共刺激分子B7-1/CD80、B7-2/CD86及DC的特征性表面标志CD83分子,以及明显刺激T细胞增殖等功能。在实验中发现,Mo在GM-CSF和IL-4存在条件下4天内开始发生DC的形态改变,但继续培养10天并给予TNF-α刺激后,这些具有典型DC形态的细胞其表面共刺激分子的上调及CD14分子的下调表达水平不均一,DC的成熟标志CD83分子表达缺乏。在CD34+HPC的诱导分化中,第一周给予GM-CSF、TNF-α和SCF培养,可将细胞总数扩增113±29(n=5)倍,第二周给予GM-CSF、IL-4和TNF-α继续培养,许多有核细胞获得DC的形态及特征性表面标志,包括高水平表达HLA-DR、CD40、CD86和细胞间黏附分子CD54分子等,但细胞表面共刺激分子B7-1/CD80及DC的特征性成熟标志CD83分子的表达仍很弱。另外,上述组合性细胞因子培养获得的DC除了表面共刺激分子、黏附分子及某些有利于抗原呈递的分子表达太少甚至缺乏,还存在培养时间长(2周甚至更长时间)、所需成本高、获得产量低等问题,而且该培养体系中必须使用血清,增加了实验研究的许多不确定性。因此,有必要寻找快速、高效、无血清诱导DC分化成熟的方法。 在APC的功能研究中,一些实验室发现,细胞内钙动员剂可以绕过常规的细胞因子受体/配体的信号转导途径来增加Mo的抗原呈递功能。因此我们选用钙离子载体(calciumionophore,CI)作为主要试剂,对其在诱导Mo、CD34+HPC向DC分化成熟中的作用及其信号机制进行了探索。Mo经CI处理20小时即迅速发生向DC分化的形态改变;CI处理40小时,即迅速出现DC特征性表面标志的改变,包括下调单核巨噬细胞的表面标志CD14分子(LPS的受体),迅速增加MHC分子的表达及上调B7.2、CD40、CD54分子的表达,以及新表达DC活化成熟相关标志CD80、CD83分子;而且获得较组合性细胞因子诱导组更强的刺激T细胞增殖的能力。CD34+HPC经2步法扩增诱导后再给予CI处理20小时,共刺激分子CD80、CD86分子的表达明显上调,成熟DC的特征性标志CD83分子的表达增高,与无CI处理组相比其刺激同种异体T细胞增殖的能力更高。实验结果表明,Mo及CD34+HPC都可以被CI快速诱导成具有成熟DC形态和功能的细胞。 细胞因子(cytokine,CK)主要通过细胞因子受体/配体膜信号转导机制,激活NF-κB,诱导DC的分化。为探讨CI诱导Mo分化为DC的信号转导途径,在实验中我们引入3种Ca2+/CaM活化途径的抑制剂(W-7、CsA、KT5926)进行研究。W-7作为Ca2+调节蛋白(calcimodulin,CaM)的拮抗剂,强烈地抑制由CI诱导的Mo向DC分化的信号转导途径,包括抑制树突状细胞形态的改变、阻断CD14分子的下调及阻断CD83、CD80、CD86分子的上调。环孢菌素A(cyclosporinA,CsA)为蛋白磷酸酶(calcineurin,CaN)拮抗剂,一定程度地抑制了树突状细胞形态的改变、下调细胞表面CD83、CD80和CD86等分子的表达并抑制其对同种异体T细胞增殖的刺激作用,但不抑制CD14分子表达的下调。KT5926为CaM的蛋白激酶(calmodulin-dependentproteinkinases,CaMK)抑制剂,虽强烈地抑制CD14分子的下调,却对细胞表面共刺激分子及CD83分子等的表达影响很小。还发现,上述抑制剂对rhGM-CSF+IL-4+TNF-α所诱导的DC分化基本没有影响。结果提示,CI诱导Mo向DC的分化,可能受控于Ca2+/CaM及其下游的多个信号转导途径的调节;而且由CI诱导Mo向DC分化的信号,与组合细胞因子的受体/配体介导的膜信号转导途径不同,CI通过提高胞浆游离Ca2+浓度,激活依赖Ca2+的基因转录,结果比组合性细胞因子更快地诱导Mo分化为DC;但细胞因子可协同CI诱导的DC分化,说明在Mo向DC的分化过程中,有多种信号途径在起作用。应用凝胶电泳迁移率变动分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)检测不同方法培养细胞的核转录因子-κB(nucleartranscriptionfactor-κB,NF-κB)的活化水平,发现Mo经GM-CSF诱导后其NF-κB的活性为阴性;GM-CSF+IL-4+TNF-α诱导DC的NF-B活性最高,CsA基本不影响其NF-κB活性;GM-CSF+CI所诱导DC的NF-κB的活性也较高,但CsA对之有明显抑制作用。结果提示,由CI诱导Mo向DC分化的信号与细胞因子诱导者不同,主要与Ca2+/CaM信号转导途径有关;但不论其上游信号转导途径如何不同,CI及CK最终都通过激活NF-κB来诱导细胞的分化。 在研究髓系白血病、淋巴系白血病、淋巴瘤以及多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤时,人们发现这些原始的恶性肿瘤细胞表面缺乏有效地激活T细胞所必须的共刺激分子,但一些细胞刺激剂可以诱导这些恶性细胞表达共刺激分子,从而增强其APC功能。例如将慢性白血病(chronicmyelogenousleukemia,CML)患者的骨髓细胞或Mo给予组合性细胞因子GM-CSF+IL-4+TNF-α等刺激后,Ph+的恶性细胞部分可以被诱导成DC样细胞,从而增强了这些Ph+白血病细胞的APC功能。同样,急性白血病(acutemyelogenousleukemia,AML)患者的外周血细胞可以被组合性细胞因子GM-CSF、TNF-α、SCF和IL-6等诱导朝DC方向分化。这些结果提示至少某些急、慢性白血病患者的CML细胞或AML细胞对某些正常的细胞刺激信号有反应,可以被其诱导而分化成DC样细胞,导致其APC功能提高。因此,希望了解AML细胞在体外能否被CI诱导分化为DC样细胞。该文将7例AML患者的AML细胞分别给予CI或CK包括GM-CSF、IL-4和TNF-α刺激培养2周,发现在这2种条件下,AML细胞均可被诱导分化为DC样细胞,但CI诱导的DC表面CD80、CD86、CD83、CD40、CD54等分子的表达明显高于CK诱导者;CI所诱导的AML细胞刺激混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)的能力及激发细胞毒性T淋巴细胞(cytolyticTlymphocyte,CTL)的活力比CK诱导者强。 该文结果表明,组合性细胞因子诱导生成的DC其表面共刺激分子和DC成熟标志CD83等分子的表达以及刺激T细胞增殖的活性均不理想,而CI通过与组合性细胞因子不同的信号转导途径,比之能更快速高效地诱导Mo、CD34+HPC及AML细胞向DC分化,且后者的功能活性比细胞因子诱导者强。这些发现,对于DC的基础研究和临床应用均具重要意义。
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