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(R)-（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）-甲醇[（R）-CPMA]是合成抗组胺药物倍他司汀的关键手性中间体。目前化学法合成（R）-CPMA占主要地位,但生物酶催化法由于其反应条件温和、选择性高和转化率高等优点,逐渐成为国内外研究的热点。在前期工作中,本课题组通过基因挖掘技术从Kluyveromyces polyspora中成功筛选得到NADPH依赖型的短链醇脱氢酶KpADH,其不对称还原（4-氯苯基）-（吡啶-2-基）-甲酮（CPMK）生成（R）-CPMA的选择性达到82%。本论文以KpADH为出发酶,对其进行了半理性设计,活性位点研究,底物谱分析,蛋白结晶等研究工作。主要研究内容如下:首先,利用半理性设计提高醇脱氢酶KpADH的对映选择性。利用氨基酸密码子的简并性,设计疏水性分类组合饱和诱变（hydroclassified combinatorial saturation mutagenesis,HCSM）策略构建组合饱和突变库。筛选得到最优突变体50C10（C165F/E214Y/S237A）,其不对称还原CPMK的e.e.值为99.4%（R）,kcat/Km从16.7提高到至59.3 s–1·mM–1。对于8种双芳基酮底物,50C10显示出高于WT的比活力和对映选择性,尤其是对溴二苯甲酮,对硝基二苯甲酮和二苯乙酮的光学纯度都大于99%。利用50C10不对称合成（R）-CPMA。采用分批法补加500 mM CPMK,12 h反应转化率99%,回收率为88.6%,e.e.值>99%。基于HCSM文库筛选结果,发现214和237位点是KpADH立体选择性调控的关键位点。结合定点饱和突变和组合突变的方法,研究214和237位点氨基酸残基极性和位阻的变化对立体选择性的影响。经过两轮突变后,得到突变体E214Y/S237A,其不对称还原CPMK生成（R）-CPMA的e.e.值达到了99.1%;同时筛选得到了构型反转的突变体E214G/S237C,e.e.值为75.6%（S）。在单点突变的研究中,仅E214G单突变的立体选择发生了轻微反转（6.71%（S））,说明了组合效应对于KpADH的选择性反转的重要性。突变体E214Y/S237A和E214G/S237C对CPMK的Km较WT（0.78 mM）有所降低,是0.62和0.31 mM。为深入探索KpADH的手性识别机制,解析了KpADH-NADP复合物晶体结构。利用座滴法进行晶体的初筛及优化,在0.2 M醋酸铵,0.1 M HEPES,pH 7.0,31%PEG3,350,1 mM NADPH,5%异丙醇条件下得到高质量蛋白晶体。通过X-ray衍射得到分辨率1.98?的晶体数据,并利用分子置换法解析了KpADH-NADP的复合物结构。基于晶体结构和计算机分析,214和237位点空间位阻的改变是导致E214Y/S237A和E214G/S237C选择性的提高和反转主要原因。综上,本研究本设计了高效突变策略对KpADH的立体选择性进行了改造,并基于热点分析和晶体结构初步探索了其的手性识别机制。