僵蚕产地相关蛋白质分子标记的挖掘与研究

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僵蚕为蚕蛾科(Bombycidae)昆虫家蚕(Bombyx mori L.)幼虫感染白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体,始载于《神农本草经》,应用历史悠久,具有除痰化结、祛风定惊等功效。僵蚕是一种多产地药材,而不同产地生态因子会影响僵蚕的品质。因此,有必要建立僵蚕产地溯源技术,以保证僵蚕药材品质,规范药材市场。本文旨在探究僵蚕蛋白质的优化提取工艺,并以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及改进的丙酮分级沉淀(AFP)/Tricine-SDS-PAGE技术研究僵蚕蛋白质组成,分析其差异表达蛋白质分子,为挖掘僵蚕产地溯源相关蛋白质分子标记及进一步阐明环境因子对各产地僵蚕品质形成的影响提供理论依据。主要研究结果如下:1、建立了僵蚕醇溶蛋白质的优化提取工艺,并建立相应的SDS-PAGE、HPLC、FTIR指纹图谱。结果表明:僵蚕醇溶蛋白质的最佳提取工艺条件为料液比1:24.22g·mL-1,乙醇浓度38.73%,温度35℃,提取时间3.94 h,此时提取率为0.5402%。SDS-PAGE结果表明僵蚕醇溶蛋白质分子量集中在16.7~36.2 kDa;HPLC结果表明主要僵蚕醇溶蛋白质的保留时间为2.048 min与3.354 min,其含量分别占总蛋白量的31.23%与32.93%;FTIR结果表明僵蚕醇溶蛋白质在2927.71、1631.71、1457.24、1310.71 cm-1处有主要吸收峰。2、建立了可用于僵蚕药材鉴定的优化的蛋白质SDS-PAGE指纹图谱。采用0.1 M HAc-NaAc缓冲液(pH 4.3)、0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、ddH2O和40%乙醇提取滇产、川产僵蚕蛋白质,并进行SDS-PAGE分析,结果表明,当蛋白质加样量为20μg,凝胶浓度为14%时,僵蚕蛋白质指纹图谱达到最佳分辨率。硝酸银染色法较考马斯亮蓝法灵敏度更高,而Tricine-SDS-PAGE更适用于分析僵蚕中的小分子蛋白质。3、挖掘滇产、川产僵蚕中差异表达蛋白质分子,并对其进行LC-MS/MS鉴定及生物信息学分析。以0.1 M HAc-NaAc缓冲液(pH 4.3)、0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、ddH2O和40%乙醇分别提取滇产及川产僵蚕蛋白质,并进行改进的AFP/Tricine-SDS-PAGE分析,凝胶对比共发现16条多态性条带,LC-MS/MS鉴定共计获得273个得分值≥1.3的差异表达分子。同时对差异表达分子进行生物信息学分析,结果表明这些差异表达分子主要分布在细胞有机体、细胞核以及细胞质中,其分子功能分类主要包括催化活性以及结合功能,其生物学过程主要集中在细胞进程、代谢进程、应激反应、生物调节等,其中糖类代谢运输相关蛋白质含量占比最高,达到25.78%,蛋白质转化、修饰相关蛋白质及分子伴侣蛋白含量占比次之,达到23.83%,并且这些差异分子主要涉及了次生代谢产物的生物合成信号通路、微生物代谢信号通路、抗生素的生物合成信号通路、碳代谢信号通路、氨基酸生物合成信号通路等。上述通路可能为僵蚕产地环境因子的重要作用靶点,对不同产地僵蚕品质形成有重要影响,亦为建立基于专属性蛋白质分子标记的僵蚕产地溯源技术提供重要参考及依据。
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