论文部分内容阅读
研究背景:胰腺癌是最常见的消化道肿瘤之一,其发病率逐年增加。由于早期缺乏典型的临床症状,大多数患者就诊时往往出现肿瘤周围浸润和远处器官的转移,预后极差。据美国癌症协会预测,胰腺癌将成为第三大肿瘤相关致死病因,在世界范围内每年造成227000人死亡。尽管基础研究的深入和医学标准的进步,基于肿瘤手术切除的综合治疗策略取得了良好的效果,但胰腺癌病患的5年生存率仍然小于8%。面对严峻的形势,创新有效的治疗策略迫在眉睫。EZH2 全称 Enhancer of Zeste Homolog 2,是多梳蛋白抑制复合物 2(polycomb repressive complex 2,PRC2)的催化亚基,能催化组蛋白H3第27赖氨酸位点的三甲基化,从而在转录水平引起靶基因的沉默。大量文献报道,EZH2在多种肿瘤的进展中发挥着重要的作用,如乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤和血液系统的恶性肿瘤等。GSK343是一种选择性的EZH2抑制剂,能够通过竞争抑制甲基供体S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-Methionine,SAM)来发挥作用。而EZH2在癌症中高表达,与肿瘤的预后与转移有着密切的关系,抑制EZH2被认为是一种新颖的潜在的治疗癌症的方向。在本研究中,我们选用了两株胰腺癌细胞株AsPC-1和PANC-1,旨在探究EZH2抑制剂GSK343在胰腺癌中的作用及其机制,为胰腺肿瘤的治疗提供新思路和方法。研究方法:1、GSK343在不同胰腺癌细胞系中IC50的确定不同浓度的GSK343处理胰腺癌细胞,运用MTT法检测GSK343在胰腺癌细胞系AsPC-1和PANC-1中的IC50浓度,并绘制细胞活力-药物浓度曲线。2、GSK343对于胰腺癌细胞生物学行为的影响1)选择合适的浓度,分别运用CCK-8和EdU实验检测GSK343对胰腺癌细胞增殖能力影响。2)选择适宜的浓度,采用流式细胞术分析GSK343对胰腺癌细胞凋亡的影响。3)选择恰当的浓度,使用流式细胞术分析GSK343对胰腺癌细胞周期的影响。3、GSK343诱导胰腺癌细胞自噬及其机制探索1)运用免疫荧光技术,在荧光显微镜下观察LC3B-Ⅱ的浓聚,检测GSK343对于胰腺癌细胞自噬的影响。2)选择合适的浓度,Western-blotting方法检测ATG5和LC3B的表达,从而检测GSK343诱导胰腺癌细胞自噬的能力。3)加入合适的GSK343后,继续采用Western-blotting方法检测AKT、p-AKT(ser473)、mTOR及p-mTOR(ser2448)的表达,探索GSK343诱导胰腺癌细胞自噬的可能机制。实验结果:1、GSK343在不同胰腺癌细胞系中IC50值MTT方法显示,GSK343在胰腺癌细胞系 AsPC-1 中的IC50值为12.71±0.41μmol/L,而在胰腺癌细胞系 PANC-1 中的 IC50 值为 12.04± 1.10μmol/L,两者之间没有明显统计学差异。2、GSK343对于胰腺癌细胞生物学行为的影响CCK-8及EdU实验显示,加入GSK343后两种胰腺癌细胞系增殖能力显著降低;流式细胞术分析发现,GSK343能够增加胰腺癌细胞的凋亡率,阻滞细胞周期于GO/G1期。3、GSK343诱导胰腺癌细胞自噬及其机制探索1)免疫荧光技术发现,加入合适浓度的GSK343后,LC3B-Ⅱ显著浓聚,而Western-blotting方法检测显示,ATG5的表达未发生变化,LC3B-Ⅰ的表达显著下降,而LC3B-Ⅱ的表达显著上升,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 比值增大。2)适宜的浓度处理胰腺癌细胞后,Western-blotting方法显示AKT及mTOR的表达未发生明显变化,而p-AKT(ser473)及p-mTOR(ser2448)的表达显著降低。实验结论:1、GSK343作用于胰腺癌细胞系AsPC-1和PANC-1中的IC50值相似,对胰腺癌细胞有普遍的杀伤作用,在胰腺癌的临床治疗中有一定的应用前景。2、GSK343能够有效抑制胰腺癌细胞的增殖,诱导胰腺癌细胞的凋亡,并阻滞细胞周期于G0/G1期。3、GSK343能够诱导胰腺癌细胞自噬并下调AKT/mTOR信号通路,这可能是GSK343发挥抑癌作用的重要机制之一。