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肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,我国是肝癌发病重灾区,病例占全球肝癌病例的50%以上,其患病率和死亡率均居亚洲乃至全球之首位,且其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重危害了人民的身体健康。肝癌属于实体恶性肿瘤,低/缺氧是实体恶性肿瘤的重要特征之一。缺氧可通过促进肝癌细胞的增殖/侵袭和血管生成,在肝癌的发生、发展和化疗后肝癌的复发中发挥重要作用。目前,肝癌的治疗方法主要集中在手术、消融、肝移植、动脉介入治疗、化疗及联合治疗。由于肝癌前期症状较隐蔽,早期诊断困难,临床明确诊断时多数患者已处于中晚期。对于中晚期的肝癌患者,化疗是其主要的治疗手段,然而肿瘤的低/缺氧微环境会使肿瘤对化疗的敏感性降低,产生耐药性。因此,研究还原性抗肿瘤药物在低/缺氧条件下的抗肿瘤机制,可为探索能够提高低/缺氧性肿瘤化疗效果的方法、寻找能够利用肿瘤低氧微环境的药物提供借鉴,这是目前低/缺氧性肿瘤治疗亟待解决的问题。硒具有还原性且具有抗癌作用,但硒的抗癌机理尚未研究清楚,尤其是在肿瘤低氧微环境中的作用机制尚无研究报道。硒化氢（H2Se）是膳食硒类化合物的共同中间代谢产物,是一种高还原性硒化物,具有很高的挥发性和反应性,很难直接在细胞和动物模型中检测到,以往由于缺乏检测方法,其作用尚未被阐明。本研究借助能够特异性检测H2Se的荧光探针揭示硒的一种新的抗肝癌机制。在模拟肿瘤微环境（低氧）的条件下,药理浓度的亚硒酸钠作用于肝癌细胞后,细胞内H2Se水平明显升高,而且H2Se水平的升高发生在细胞死亡之前。H2Se水平升高的同时也伴随着还原胁迫标志性分子NAD（P）H和GSH的升高。活性氧检测结果显示,在此过程中H2O2含量并没有发生明显变化。因此,低氧条件下,H2Se在细胞内的积累引起了还原性胁迫而非氧化胁迫。然而,在常氧条件下,药理浓度的亚硒酸钠作用于肝癌细胞后,细胞内H2Se水平并没有升高,而是出现了H2O2含量升高的现象,产生了氧化胁迫。进一步研究发现,低氧条件下,亚硒酸钠作用于肝癌细胞后代谢产生的H2Se能够打断HMGB1蛋白内的二硫键使HMGB1蛋白处于还原状态,还原型的HMGB1分泌到细胞外发挥信号分子作用,诱导细胞发生自噬。清除H2Se后自噬明显减弱。在此,自噬发挥了双重作用:轻度的自噬能够抑制细胞凋亡,而过度的自噬最终导致细胞发生自噬相关性死亡。不同的是,常氧条件下,亚硒酸钠代谢产生的H2Se迅速被氧化生成活性氧,进而引起氧化胁迫;氧化型HMGB1蛋白分泌到细胞外,诱导细胞发生凋亡。这些结果表明,H2Se在亚硒酸钠诱导的肝癌细胞死亡过程中起着关键作用,在不同的氧气浓度下H2Se发挥不同的作用,可将H2Se作为硒治疗癌症的研究靶点,探索提高硒治疗低/缺氧性肿瘤效果的新方法。天然抗氧化剂（如白藜芦醇、姜黄素、雷公藤红素等）是生物体在长期进化过程中,为抵抗环境理、化因子和自身代谢产生的活性氧而生成的自我保护性物质,具有抗炎、抗氧化、清除自由基的作用。近年来的研究发现,白藜芦醇、姜黄素和雷公藤红素除了具有抗炎、抗氧化等作用外,还具有抗肿瘤作用,但其抗肿瘤机制并不明确,研究结果存在较大争议。本论文借助能够特异性检测还原胁迫标志性分子NAD（P）H的小分子荧光探针发现,在模拟肿瘤微环境（低氧）的条件下,药理剂量的白藜芦醇、姜黄素或雷公藤红素诱导肝癌细胞死亡之前均出现了NAD（P）H升高的现象,而活性氧含量无明显变化。NAD（P）H的增多导致了还原性胁迫而非氧化胁迫;然而,在常氧条件下,白藜芦醇、姜黄素和雷公藤红素诱导细胞死亡过程中NAD（P）H含量并没有明显变化。推测,在肿瘤缺氧微环境下,天然抗氧化剂可能通过还原性胁迫诱导肿瘤细胞死亡。为了进一步研究还原胁迫的作用,我们选取白藜芦醇为例借助转录组学研究手段分析了低氧条件下天然抗氧化剂的抗肝癌机制。氧化还原相关基因分析显示,低氧条件下白藜芦醇作用肝癌细胞后氧化还原相关基因表达上调的比例占94.2%。GO功能富集分析显示,这些基因主要参与了氧化还原过程、细胞内的氧化还原平衡调控和发挥氧化还原酶活性的功能。对氧化还原酶活性功能进一步分析发现,低氧条件下白藜芦醇作用细胞后,氧化还原酶可催化NAD（P）+生成NAD（P）H,而常氧条件下氧化还原酶则催化NAD（P）H生成NAD（P）+。这与用NAD（P）H荧光探针检测的结果（低氧下白藜芦醇作用后NAD（P）H水平升高,而常氧下无明显变化）是一致的。抗氧化酶基因分析结果表明,低氧条件下白藜芦醇作用细胞后,具有显著差异的抗氧化基因表达全部上调。以上结果提示,低氧下白藜芦醇作用于肝癌细胞后没有引起氧化胁迫而是产生了还原性胁迫。KEGG信号通路富集结果表明,低氧条件下白藜芦醇作用肝癌细胞后主要激活了肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和自噬相关信号通路。分析还发现,白藜芦醇作用肝癌细胞后,出现了一些低氧条件下表达上调而常氧条件下表达下调的基因或低氧条件下表达下调而常氧条件下表达上调的基因。这些在不同氧气条件下表达相反的基因可作为还原胁迫研究的靶点。总之,本论文研究结果揭示了硒和天然抗氧化剂治疗低/缺氧性肿瘤的新机制,明确了还原胁迫在低/缺氧性肿瘤治疗中的作用,为硒和天然抗氧化剂类药物治疗低/缺氧肿瘤的研究提供了一个新的研究方向。并提出还原剂类/抗氧化剂类抗肿瘤药物的研究应该在相应的肿瘤低氧条件下进行,因为不同的氧气条件可能会导致不同的研究结果,这可能也是导致许多理论研究结果与临床测试不符的原因之一。