研究背景:长链非编码RNAs（Long non-coding RNAs,lncRNAs）作为人体微观生命活动中的重要调控因子,其在胃癌（Gastric cancer,GC）发病机制中的关键作用已得到广泛关注。本课题组前期利用3例胃癌与癌旁正常组织样本构建了3vs.3胃癌组织基因表达谱芯片,发现了上百种在胃癌中具有差异表达的lncRNAs。其中,SNHG7是一种在胃癌与正常组织中具有差异高表达水平的lncRNA（Fold change=2.01,P=4.53E-2）,且是一种新兴热点的基因间lncRNA（Long intergenic non-coding RNA,lincRNA）。研究表明,lincRNA SNHG7在多种癌组织中表达上调,且可通过多种复杂通路影响肿瘤细胞的生物学行为,包括增殖、凋亡、侵袭转移及上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）等。然而,目前关于SNHG7与胃癌的关联研究仍较为局限,且针对其在胃癌中的功能研究实验证据的效力参差不齐,结果也不尽一致。N~6-甲基腺嘌呤（N~6-methyladenosine,m~6A）甲基化修饰是真核生物中最常见的转录后修饰,同样可以影响包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展。研究表明,m~6A相关的lncRNAs可能在胃癌的进展过程中起着不可忽视的调控作用。作为众多lncRNAs非常重要的上游调控节点,SNHG7是否存在功能性m~6A修饰,其表达和功能是否受m~6A水平的调控,从而影响其对胃癌细胞生物学行为的作用,均尚处未知。研究目的:探讨lincRNA SNHG7与胃癌的相关性,阐明基于m~6A修饰调控的lincRNA SNHG7影响胃癌细胞生物学行为的作用机制。研究方法:第一部分:LincRNA SNHG7与胃癌的关联研究1、研究对象:本部分体内研究所利用的55例胃癌组织样本选自2014年12月至2020年10月间在中国医科大学附属第一医院肛肠外科住院并接受胃大部切除术的胃癌患者。体外研究共利用4种胃粘膜细胞系,包括GES-1正常胃粘膜细胞系、AGS胃癌细胞系、HGC-27胃癌细胞系以及MKN-45胃癌细胞系,均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。2、胃癌组织基因表达谱芯片的构建由博淼生物科技有限公司（中国北京）实施。实验所用芯片为Agilent Human lncRNA V5（4*180K,Design ID:076500）。利用t检验进行差异基因与差异lncRNAs的筛选,筛选标准为上调或下调的倍数变化值（Fold change,FC）≥1.5且P＜0.05。3、四种细胞系中GES-1、AGS、HGC-27均在完全培养液（10%胎牛血清+1640培养基）中进行贴壁培养,MKN-45细胞系为半贴壁培养,包括细胞复苏、换液、传代与冻存。4、采用酚—氯仿法提取组织及细胞总RNA,反转为c DNA,利用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测组织与细胞中的lncRNA表达水平。5、利用Funrich数据库（v3.1.3）对SNHG7的共表达差异基因进行功能富集分析。利用SPSS软件（v22.0）进行统计学分析。采用t检验（正态分布）或非参数检验（偏态分布）分析计量资料的组间差异。采用Kaplan-Meier（K-M）分析与Cox回归分析评估SNHG7的表达水平与胃癌预后的相关性。所有检验以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。第二部分:LincRNA SNHG7影响胃癌细胞生物学行为的作用研究1、研究对象:本部分体内研究所利用的15例胃癌组织样本来源同论文第一部分。体外研究共利用2种胃癌细胞系,包括AGS与HGC-27胃癌细胞系。2、构建lincRNA SNHG7的过表达与敲减质粒载体,摇菌、提取质粒,瞬时转染胃癌细胞,构建SNHG7过表达与敲减的胃癌工具细胞。3、采用酚—氯仿法提取细胞总RNA,反转为c DNA,利用RT-q PCR检测细胞中的lncRNA与m RNA表达水平。4、利用CCK-8实验、Ed U荧光染色实验检测胃癌细胞的增殖能力;利用划痕愈合实验、Transwell迁移实验检测胃癌细胞的迁移能力;利用Transwell侵袭实验检测胃癌细胞的侵袭能力。5、利用RNA组织原位杂交实验与RNA组织荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）实验检测lincRNA SNHG7在胃癌组织细胞中的原位表达情况。6、利用SPSS软件（v22.0）进行统计学分析。采用t检验（正态分布）或非参数检验（偏态分布）评估计量资料的组间差异。所有检验以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。第三部分:基于m~6A修饰调控的lincRNA SNHG7影响胃癌细胞生物学行为的作用机制研究1、研究对象:本部分体内研究所利用的6例胃癌组织样本来源同论文第一部分,体外研究利用的细胞系为AGS胃癌细胞系。2、甲基化RNA免疫共沉淀结合二代测序（Methylated RNA Immunoprecipitation with Next Generation Sequencing,Me RIP-Seq）由云序生物科技有限公司（中国上海）实施。利用MACS软件识别每个样本中的甲基化基因,采用diff Reps软件进行差异甲基化位点的识别,筛选标准为P＜0.05且FC≥2.0。3、LincRNA SNHG7的m~6A-RNA绝对定量RT-PCR实验由康成生物工程公司（中国上海）实施。样品目的基因位点m~6A甲基化校正后的RNA含量=【（样品目的基因总c DNA浓度-目的基因位点未m~6A甲基化c DNA浓度）×RNA Spike in的RNA浓度】/RNA Spike in的c DNA浓度。4、构建lincRNA SNHG7的m~6A定点突变过表达质粒,摇菌、提取质粒,瞬时转染AGS细胞,构建SNHG7野生型与m~6A定点突变型过表达的胃癌工具细胞。5、采用酚—氯仿法提取细胞总RNA,反转为c DNA,利用RT-q PCR检测细胞中的lncRNA与m RNA表达水平。6、利用Transwell迁移实验检测AGS细胞的迁移能力;利用Transwell侵袭实验检测AGS细胞的侵袭能力。7、采用SPSS软件（v22.0）进行统计学分析。利用t检验（正态分布）或非参数检验（偏态分布）评估计量资料的组间差异。所有检验以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果:第一部分:LincRNA SNHG7与胃癌的关联研究1、基于胃癌组织基因表达谱芯片的lincRNA SNHG7生物学功能分析利用本组前期构建的3 vs.3胃癌vs.癌旁正常组织基因表达谱芯片数据,筛选出458种具有差异表达水平的m RNAs（FC≥1.5,P＜0.05）,其中121种基因与SNHG7存在共表达相关性。随后对这些共表达差异基因进行了多项生物学功能富集分析:（1）表达部位富集分析显示与SNHG7共表达的差异基因在多种组织与细胞系中具有显著的表达富集,且存在于分析背景数据集中的SNHG7共表达差异基因约有53.8%在胃癌组织中具有一定程度的表达富集（FC=1.3,P=0.004）;（2）基因功能（Gene Ontology,GO）富集分析显示与SNHG7共表达的差异基因在细胞组分、分子功能与生物学过程三个功能模块中均具有显著的富集效应（P＜0.05）;（3）Pathway富集分析显示与SNHG7共表达的差异基因在多种生物学通路中具有显著的富集效应（P＜0.05）,涉及调控细胞周期、增殖凋亡、迁移侵袭等各个方面。2、LincRNA SNHG7在胃癌组织与胃粘膜细胞系中的表达特征SNHG7在55例胃癌组织中的表达量显著高于癌旁正常组织（P=0.045）,配对FC值平均为4.0。另检测了SNHG7在几种胃粘膜细胞系中的本底表达水平,包括1种正常胃粘膜细胞系GES-1与3种胃癌细胞系AGS（中/高分化）、HGC-27（未分化）以及MKN-45（低分化）。结果显示,与GES-1细胞相比,SNHG7在HGC-27（FC=2.9,P＜0.001）与MKN-45细胞（FC=1.5,P＜0.001）中的表达量显著升高。此外,SNHG7在3种胃癌细胞系中的表达量为HGC-27细胞最高,AGS细胞最低。3、LincRNA SNHG7表达水平与胃癌临床病理参数的相关性SNHG7在胃癌组织中的表达水平与4项病理参数显著相关,包括Lauren分型、组织学分型、淋巴结转移以及周围神经侵犯,且均在偏恶性的病理分组中表达水平更高。Lauren分型中,SNHG7在弥漫型胃癌组的表达量显著高于肠型胃癌组（P=0.007）。组织学分型中,SNHG7在低分化腺癌/粘液腺癌/印戒细胞癌组中的表达量显著高于高/中分化腺癌组（P=0.007）。SNHG7在伴有淋巴结转移阳性胃癌组中的表达量显著高于阴性组（P=0.044）。SNHG7在伴有周围神经侵犯阳性胃癌组中的表达量显著高于阴性组（P=0.003）。4、LincRNA SNHG7表达水平与胃癌预后的相关性K-M单因素分析显示伴有SNHG7高表达胃癌组的累积生存率显著低于SNHG7低表达组（P=0.034）。Cox回归分析显示SNHG7的表达水平在Cox单因素与多因素分析中均与胃癌预后显著相关。单因素分析中,伴有SNHG7高表达胃癌组发生预后不良事件的风险显著高于低表达组（P=0.044,HR=3.11,95%CI=1.03-9.34）。而在多因素分析中,SNHG7高表达相较于低表达在排除淋巴结转移因素的影响后可显著提高预后不良事件的发生风险（P=0.046,HR=3.09,95%CI=1.02-9.35）。第二部分:LincRNA SNHG7影响胃癌细胞生物学行为的作用研究1、LincRNA SNHG7过表达与敲减工具细胞的构建共构建了1种SNHG7过表达质粒与3种SNHG7敲减质粒,分别利用AGS细胞与HGC-27细胞进行SNHG7过表达与敲减质粒的转染以及后续功能实验。AGS细胞中SNHG7的过表达效率平均可达700-800倍（P＜0.001）。HGC-27细胞中,有两组敲减质粒相较于空载对照组显著降低了SNHG7的表达量,平均敲减效率约为30%与40%。2、LincRNA SNHG7对胃癌细胞增殖能力的影响CCK-8实验显示过表达与敲减SNHG7后胃癌细胞的增殖活性均未发生显著改变。Ed U荧光染色实验显示SNHG7过表达后AGS细胞的增殖能力显著提高（OE-SNHG7 vs.OE-Con:P=0.003;OE-SNHG7 vs.Mock:P=0.001）,SNHG7敲减后HGC-27细胞的增殖能力显著下降（Si-SNHG7-1 vs.Si-Con:P=0.003;Si-SNHG7-2 vs.Si-Con:P=0.010）。3、LincRNA SNHG7对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响划痕愈合实验显示SNHG7过表达后AGS细胞的迁移能力显著增强（OE-SNHG7 vs.OE-Con:P=0.026;OE-SNHG7 vs.Mock:P=0.048）,SNHG7敲减后HGC-27细胞的迁移能力显著减弱（Si-SNHG7-1 vs.Si-Con:P=0.009;Si-SNHG7-2 vs.Si-Con:P=0.035）。Transwell迁移实验显示SNHG7过表达后AGS细胞的迁移能力显著增强（OE-SNHG7 vs.OE-Con:P=0.002;OE-SNHG7 vs.Mock:P=0.003）。Transwell侵袭实验显示SNHG7过表达后AGS细胞的侵袭能力显著增强（OE-SNHG7 vs.OE-Con:P=0.003;OE-SNHG7 vs.Mock:P＜0.001）。我们检测了SNHG7对EMT通路相关标志物m RNA表达水平的影响,包括Snai1、Slug、E-Cadherin以及N-Cadherin。结果显示,SNHG7过表达组AGS细胞相较于空载对照组Snai1表达量平均上调约1.4倍（P=0.004）,E-Cadherin表达量平均下调约30%（P=0.019）;SNHG7敲减组HGC-27细胞相较于空载对照组Snai1表达量平均下调约40%（Si-SNHG7-2 vs.Si-Con:P=0.001）,Slug表达量平均分别下调约35%（Si-SNHG7-1 vs.Si-Con:P=0.007）与60%（Si-SNHG7-2 vs.Si-Con:P=0.003）。4、LincRNA SNHG7影响胃癌细胞生物学行为的潜在分子通路RNA组织原位杂交实验显示SNHG7在胃癌组织中明显表达,且绝大部分定位于细胞浆,而在癌旁组织中未发现SNHG7存在明显的阳性着色。RNA FISH实验同样显示SNHG7在胃癌组织中呈现明显的荧光染色信号,且定位于细胞浆。随后利用竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA,ce RNA）网络相关生信数据库对SNHG7下游的潜在靶基因进行了预测,结果共发现12种基因可能与SNHG7互联,m RNA表达水平验证显示SNHG7过表达组AGS细胞相较于空载对照组TGFB1表达量发生了稳定的显著上调,平均达1.5倍（P=0.026）左右;SNHG7两敲减组HGC-27细胞相较于空载对照组TGFB1表达量均显著下调约30%（Si-SNHG7-1 vs.Si-Con:P=0.012;Si-SNHG7-2 vs.Si-Con:P=0.035）。第三部分:基于m~6A修饰调控的lincRNA SNHG7影响胃癌细胞生物学行为的作用机制研究1、胃癌与癌旁正常组织lincRNA SNHG7的差异m~6A甲基化片段及转录本鉴定利用与本文第一部分中构建胃癌组织基因表达谱芯片相同的3 vs.3组织样本通过Me RIP—Seq进行RNA-m~6A高通量检测,在胃癌与癌旁组织中共鉴定出191种具有差异m~6A甲基化片段的lncRNAs（FC≥2.0,P＜0.05）,SNHG7为其中一种具有差异m~6A片段的基因间lncRNA,包括一个差异高甲基化片段（319bp）和一个差异低甲基化片段（199bp）,且均富集在其同一转录本NR＿003672当中。2、胃癌与癌旁正常组织lincRNA SNHG7差异m~6A修饰位点的筛选与验证利用m~6A甲基化相关生信数据库预测SNHG7可能存在6个潜在的m~6A修饰位点。另选取3 vs.3胃癌与癌旁正常组织样本,利用m~6A—RNA绝对定量RT-q PCR方法对其中3个符合实验条件的m~6A修饰位点进行低通量甲基化率检测,包括Site422-A、Site 900-A与Site 1836-A。结果显示,900-A位点的甲基化率在3例组织样本中呈现出了一定的差异改变,其在胃癌组织中的m~6A甲基化率普遍低于癌旁组织,且在其中1例样本中出现约20%的显著下调（P＜0.001）。3、胃癌细胞lincRNA SNHG7的m~6A修饰对其表达水平的影响针对上述3个m~6A位点构建了两种SNHG7定点突变过表达质粒,包括突变-1型（Mut-1）与突变-2型（Mut-2）,其中Mut-1为Site 900-A→G单位点突变,Mut-2为Site 422-A→G+Site 900-A→G+Site 1836-A→G三位点突变,利用AGS细胞系进行质粒转染及后续功能实验。检测SNHG7的3个m~6A修饰位点在各组细胞中的甲基化率变化,结果显示Site 422-A与Site 900-A两个位点定点突变后去甲基化成功。进一步检测了各组AGS细胞中SNHG7的RNA表达水平。结果显示,相较于野生型SNHG7过表达组,突变-1型细胞的SNHG7表达量可显著上调约3.35倍（P=0.007）,突变-2型细胞的SNHG7表达量可显著上调约3.24倍（P＜0.001）,但两组突变型细胞间的SNHG7表达量未见显著差异。4、LincRNA SNHG7的m~6A修饰对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响利用Transwell迁移实验检测了SNHG7 m~6A修饰位点的甲基化率变化对AGS细胞迁移能力的影响。结果显示,相较于野生型SNHG7过表达组,突变-1型与突变-2型两组细胞的迁移能力显著增强（OE-Mut-1 vs.OE-WT:P＜0.001;OE-Mut-2vs.OE-WT:P=0.003）。利用Transwell侵袭实验检测了SNHG7 m~6A修饰位点的甲基化率变化对AGS细胞侵袭能力的影响。结果显示,相较于野生型SNHG7过表达组,突变-1型与突变-2型两组细胞的侵袭能力显著增强（OE-Mut-1 vs.OE-WT:P=0.005;OE-Mut-2 vs.OE-WT:P=0.015）。进一步检测了AGS细胞中SNHG7 m~6A修饰位点的甲基化率变化对EMT通路相关标志物中Snai1与E-Cadherin的m RNA表达水平的影响。结果显示,与野生型SNHG7过表达组相比,突变-1型与突变-2型两组细胞的Snai1表达量均显著升高,平均分别上调约1.62倍（OE-Mut-1 vs.OE-WT:P=0.031）与1.45倍（OE-Mut-2 vs.OE-WT:P=0.036）;而突变-1型与突变-2型两组细胞的E-Cadherin表达量则显著降低,均下调约35%（OE-Mut-1 vs.OE-WT:P=0.001;OE-Mut-2 vs.OE-WT:P=0.001）。5、LincRNA SNHG7的m~6A修饰对靶基因TGFB1表达水平的影响我们检测了AGS细胞中SNHG7 m~6A修饰位点的甲基化率变化对TGFB1m RNA表达水平的影响。结果显示,与野生型SNHG7过表达组相比,突变-1型与突变-2型两组细胞的TGFB1表达量均显著升高,平均分别上调约1.76倍（OE-Mut-1vs.OE-WT:P=0.016）与1.99倍（OE-Mut-2 vs.OE-WT:P=0.020）,但两组突变型细胞间的TGFB1表达量未见显著差异。研究结论:1、LincRNA SNHG7与胃癌显著关联,其在胃癌与癌旁正常组织中具有差异表达,其表达水平与胃癌的临床病理参数（Lauren分型、组织学分型、淋巴结转移以及周围神经侵犯）及预后显著相关。2、LincRNA SNHG7对胃癌细胞具有一定的促增殖作用以及显著的促迁移、侵袭作用。3、LincRNA SNHG7在胃癌组织中具有差异m~6A甲基化修饰,其m~6A修饰位点的去甲基化可显著提高其表达水平,并具有显著的促进胃癌细胞迁移、侵袭的作用。