氮（N）是植物生长的必需元素,也是增加农业投入成本的基本因素。在过去的40年里,由于不合理地施用氮肥（N）,导致在作物上的应用量急剧增加,在显著增加作物产量的同时,对环境业产生了相当大的影响。为了确保粮食安全和环境的可持续性,迫切需要科学管理氮肥地施用。鉴定或开发具有高氮利用效率（NUE）的基因型,其可以在N条件下有效生长并维持较高的产量是解决问题可能的方案之一。在中国,大米是主食,到2030年,大米需求量将增加14%,为满足这一需求,农民们盲目使用氮肥,导致氮肥施用量显著增加,但氮素利用率（NUE）相当低。为深入理解水稻（Oryza sativa L.）调控NUE的分子机制,本研究利用两种水稻近等基因系,即野生型水稻Kitaake及其蛋白磷酸酶基因（PP2C9）过表达的转基因系PP2C9TL来评估不同N水平（零N,中N（对照）,低N和高N）下的NUE表现的生理生态特性及其分子机制。蛋白磷酸酶的可逆蛋白磷酸化是调节不同生物过程的重要机制。在植物中,PP2Cs是一种主要的磷酸酶编码基因家族,已成为应激信号传导的关键调节因子。蛋白磷酸酶（PP2Cs）负调节脱落酸（ABA）信号传导。在拟南芥中,已经鉴定出PP2C蛋白如ABA不敏感的ABI1,ABI2和对ABA1的过敏的HAB1。它们可通过与SnRK2s和PYR/PYL/RCARs相互作用来调节生物和非生物胁迫下的ABA诱导的信号传导。硝酸盐转运蛋白（NPF6.3）的活性受CBL9（钙调神经磷蛋白B样蛋白9）和CIPK23复合物（CBL相互作用蛋白激酶23）调节,CBL9磷酸化CIPK23激活蛋白复合物。活化的CIPK23抑制NPF6.3的活性。然而,蛋白磷酸酶（PP2C9s）通过去磷酸化CIPK23和CBL9复合物,硝酸盐信号传导和硝酸盐转运来增强NPF6.3依赖性硝酸盐感应。基于PPIP2去磷酸化CIPK23和CBL9复合物可增强硝酸盐传感和转运的能力的研究事实,暗示着水稻中PP2C9基因的过表达可以提高水稻NUE。在我们的初步研究中,也发现蛋白磷酸酶（PP2C9）通过增强N吸收和同化对于改善水稻的NUE密切相关,然而,更深入合理的试验信息仍然缺乏,特别是关于高NUE的PP2C9调节机制问题仍然未知。据此,我们通过设计本研究以期明确:（1）蛋白磷酸酶（PP2C9）基因介导的水稻（Oyza sativa L.）的生理性能,利用差异蛋白质组学、Western blot和COIP技术鉴定并分析WT和PP2C9TL响应不同氮肥处理的表达差异蛋白质及其与NUE表现差异的作用网络。采用非损伤微测技术（NMT）分析PP2C9TL和WT根系中与N相关离子的流入和外排等生理生态特性,并利用细菌16srRNA高通量基因测序技术评价和研究水稻PP2C9基因介导的根际微生物群落及其相互作用,进而影响水稻氮素吸收利用的分子生态机理,研究如果如下:1,我们评估了不同N水平处理下两种水稻近等基因系的生理反应。结果表明,在缺氮条件下,蛋白磷酸酶（PP2C9）的过表达显着提高了水稻的生产性能。在不施氮（对照）和少施氮素下,与WT相比,在PP2C9TL中,类似地,PP2C9TL比WT有更高的叶绿素含量。PP2C9TL中硝酸还原酶（NR）,谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酰氨合成酶（GS）的酶活性在抽穗期比WT高,在成熟时才下降,而在低N条件下PP2C9TL的谷氨酸脱氢酶（GDH）活性到成熟时也较高。为了估计氮吸收和NUE,我们测量了在中N（对照）和低N条件下PP2C9TL和WT植株的N含量。结果发现,在低N条件下两种基因型水稻在抽穗期植株N含量差异显著。与WT相比,PP2C9TL显示出有效的N摄取,表现出更高的NUE并且产生比WT更高的产量。分析PP2C9TL和WT的产量之间的差异发现,在中N下两者的产量差异比低N下更大,即产量差异随施N水平的增加而降低。在低N条件和种植密度一致的情况下,PP2C9TL产量（58g/盆）比WT（43g/盆）更高。低N水平下PP2C9TL的产量几乎等于中N水平（对照）的WT产量,这些结果表明PP2C9TL能够通过消耗较少的N产生较高稻谷产量。在高N条件下,PP2C9TL无效分蘖高和成熟时光合同化物向谷物的低效运输,导致产量没有显著增加。在特定N水平下这种产量差异也证实了两种水稻基因型之间NUE的遗传差异。生理性状表现也说明两种水稻基因型之间在生育后期,即抽穗后10 DAF显示出显着差异,显然PP2C9TL的NUE表现优于WT,但其分子机制还有待进一步研究。因此,我们设计了在水稻生育后期即10 DAF的关键时序的这两种近等基因系叶片差异蛋白质组学实验。2.两种水稻近等基因系即WT和PP2C9TL用于比较在中N（对照）和低水平N条件下的叶片蛋白质组差异表达分析,以鉴定特异性蛋白质和编码与高NUE相关的基因及其作用网络。2D凝胶电泳用于进行差异蛋白质组学分析。在低N水平下,两个等基因系水稻叶片蛋白组之间差异表达了 30个蛋白质点,其参与能量,光合作用,N代谢,信号传导和防御机制的过程。这些鉴定的蛋白质富含几种途径,包括糖酵解,卡尔文循环,TCA循环,谷氨酸合酶和硝酸还原酶,碳水化合物代谢和防御,其中三种我们感兴趣的调节蛋白被鉴定为PP2C9,14-3-3家族和SnRK。PP2C9涉及几种蛋白质的磷酸化/去磷酸化,因此很可能参与改变信号传导途径。此外,我们还发现蛋白磷酸酶可通过下调SnRK1和14-3-3蛋白来增强硝酸还原酶的活化。14-3-3s可通过与SnRK1和PP2C9的相互作用调节C和N代谢。由于14-3-3蛋白质是作物中高度保守的蛋白质,直接参与NR失活机制,NR活性被认为是对于氮吸收和同化最重要的因素,涉及这一过程的机制是低氮中PP2C9TL有较高NUE的最可能原因。我们通过蛋白质印迹分析证实了上述14-3-3蛋白的下调表达。此外,为了探究可能与PP2C9发生互作的蛋白,作者应用COIP技术从PP2C9TL和WT中富集了所有可能产生互作蛋白质复合物,并进行了免疫沉淀分析,其结果验证了上述比较蛋白质组学获得的结果及其作用网络,因为大多数鉴定的蛋白质与2DE蛋白质相似并参与光合作用,能量,N代谢,信号级联和防御机制。综合Co-IP和2DE鉴定的差异蛋白质及其互作结果,认为导致PP2C9TL在低氮条件下的NUE高于WT的主要机制是在低氮条件下PP2C9TL通过上调表达PP2C9蛋白,降低14-3-3和SnRK1d的表达丰度,并通过相关蛋白互作而引起一系列生化反应的结果。3.为了深入揭示PP2C9介导的植物与根际微生物活动之间的相互作用,我们采用了细菌16S rRNA基因的高通量测序技术,研究了低氮和正常氮（中氮）处理下水稻根际,根表和根内内生细菌群落分布及其多样性。结果表明,PP2C9TL可以在低氮处理下增加水稻根际和根际细菌群落的多样性。Proteobacteria,Firmicutes,Actinobacteria,Bacteriodetes,Chloroflexi 和Acidobactria的相对丰度增加,有利于促进根际土壤中氮的循环和转化。采用非侵入性微测试技术检测根尖离子通量,结果表明,在低氮条件下,在根系特异过表达PP2C9转基因水稻PP2C9TL能够吸收更多的Ca2+和NO3-。最后,综合PP2CPTL在不同N素处理下的生理生态特性及其分子生物学机制,结果认为,PP2C9TL转基因水稻在低氮下通过更高上调PP2C9的表达量,有效降低14-3-3家族成员和SnKR1的表达丰度以及有力调节相关蛋白的互作机制,实现更旺盛的根系生长,更活跃根系活性,从而显著增加其根系的营养吸收表面积,活化根系的NR活性,达到增加根系的氮素吸收量和利用率,进而实现高产增效的目的,而在高氮和正常氮（中N）水平下这一基因作用不明显,因而产量与NUE没有显着差异。该研究结果为我们从水稻蛋白质组水平上深入探究提高水稻NUE路径提供了新的见解,也为制定提高谷类作物NUE的新策略提供参考。