论文部分内容阅读
植物表皮毛是特化的表皮细胞，也是植物自我保护的屏障。拟南芥表皮毛通常是单细胞的，有分支的和非分泌型的。拟南芥表皮毛发育受转录因子复合体的控制，此复合体由R2R3MYB、WD40repeat（WDR）和basic helix–loop–helix（bHLH）转录因子家族蛋白组成。番茄多细胞表皮毛发育机制和拟南芥单细胞发育机制不同，发育机制尚不明确。生长素作为最早发现的植物激素，控制植物生长的方方面面。生长素喷施番茄秧苗可大幅提高叶片表面Ⅱ型，V型和Ⅵ表皮毛的密度。Aux/IAA蛋白和ARF蛋白在生长素信号转导过程中发挥了重要作用。ARF家族转录因子可发挥转录激活或抑制作用。本研究对番茄生长素响应基因SlARF4以及其下游调控网络进行了分析，主要结果如下：
①定量PCR结果表明：SlARF4基因在番茄各组织中均有表达，在表皮毛组织中表达水平最高。GUS启动子染色表明：SlARF4基因在番茄叶片表面Ⅱ型，V型，Ⅵ型表皮毛组织中均有表达。SlARF4基因转基因株系具有以下表型。第一，对番茄叶片完全展开和未完全展开两个阶段分析表明，超量表达SlARF4基因后番茄叶片表面Ⅱ型，V型和Ⅵ型表皮毛密度增加。抑制表达SlARF4基因可降低上述三种表皮毛密度。第二，超量表达SlARF4基因增加了表皮细胞的密度；抑制表达SlARF4基因降低了表皮细胞的密度。超量表达SlARF4基因上述三种表皮毛和表皮细胞的比值增加。抑制表达SlARF4基因后上述三种表皮毛和表皮细胞的比值降低。第三，抑制表达SlARF4基因降低了番茄植株对生长素处理的响应能力。第四，气相色谱-质谱连用技术（GC-MS）结果表明：SlARF4正向调控了叶片提取物中萜类物质（y-Elemene、β-Caryophyllene和α-humulene）含量。SlARF4基因超量表达株系抗害虫朱砂叶螨能力增强；SlARF4基因抑制表达株系抗朱砂叶螨能力减弱。
②RNA-Seq方法分析了RNAi-SlARF4转基因株系转录组的变化。RNA-Seq鉴定了398个差异表达基因，包括在RNAi株系中的275个上调表达基因和123个下调表达的基因。其中，SlTHM1基因启动子区域具有生长素作用原件AuxRE（TGTCTC）；SlMYB52基因启动子区域含有TGA作用原件（AACGAC）。凝胶阻滞（EMSA），双荧光素酶和免疫共沉淀（ChIP）实验表明：SlARF4结合SlTHM1和SlMYB52基因的启动子并且抑制了他们的表达。杂交实验结果表明：SlARF4依赖SlTHM1和SlMYB52基因发挥对表皮毛的调控作用。
③SlTHM1基因在番茄各组织中均有表达，在表皮毛组织中表达水平最高。GUS启动子染色表明：SlTHM1基因在叶片表面Ⅱ型，Ⅵ型表皮毛组织中表达，在V型表皮毛中不表达。SlTHM1定位在细胞核中，并具有转录激活活性。番茄中，抑制表达SlTHM1基因可特异性增加Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛密度，表皮细胞密度，Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛和表皮细胞的比值以及番茄植株对生长素的响应能力。抑制表达SlTHM1基因还增强了萜类物质的含量和番茄植株对朱砂叶螨的抗性。SlMYB52基因在番茄各组织中均有表达。GUS启动子染色表明：SlMYB52基因在叶片表面V型表皮毛组织中特异性表达，在其他类型表皮毛中不表达。SlMYB52定位在细胞核中。番茄中，抑制表达SlMYB52基因可特异性增加V型表皮毛密度，表皮细胞密度，V型表皮毛和表皮细胞的比值以及番茄植株对生长素的响应能力。抑制表达SlMYB52基因不改变番茄植株对朱砂叶螨的抗性。
④SlCycB2是B类型细胞周期蛋白，在表皮毛的形成、萜类物质代谢以及植株抗逆性中发挥了关键作用。EMSA和双荧光素酶的实验结果表明：SlTHM1和SlMYB52可结合SlCycB2基因启动子并激活了它的表达。SlIAA15基因敲除突变体中Ⅱ型、V型和Ⅵ型表皮毛的密度极显著高于野生型。EMSA和双荧光素酶的实验结果表明：SlTHM1和SlMYB52可结合SlIAA15基因启动子并激活了其表达。
综上所述，R2R3MYB生长素信号转导通路在调控番茄表皮毛叶片形成发育过程中发挥了重要作用。生长素诱导SlARF4基因表达，SlARF4蛋白抑制了下游SlTHM1和SlMYB52基因表达。SlTHM1和SlMYB52通过调控下游基因SlCycB2和SlIAA15分别调控了番茄叶片表面多细胞和单细胞表皮毛的形成。Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛密度增加增强了番茄植株对朱砂叶螨的抗性，为使用基因工程手段增强植物抗生物胁迫能力提供了新的策略。
①定量PCR结果表明：SlARF4基因在番茄各组织中均有表达，在表皮毛组织中表达水平最高。GUS启动子染色表明：SlARF4基因在番茄叶片表面Ⅱ型，V型，Ⅵ型表皮毛组织中均有表达。SlARF4基因转基因株系具有以下表型。第一，对番茄叶片完全展开和未完全展开两个阶段分析表明，超量表达SlARF4基因后番茄叶片表面Ⅱ型，V型和Ⅵ型表皮毛密度增加。抑制表达SlARF4基因可降低上述三种表皮毛密度。第二，超量表达SlARF4基因增加了表皮细胞的密度；抑制表达SlARF4基因降低了表皮细胞的密度。超量表达SlARF4基因上述三种表皮毛和表皮细胞的比值增加。抑制表达SlARF4基因后上述三种表皮毛和表皮细胞的比值降低。第三，抑制表达SlARF4基因降低了番茄植株对生长素处理的响应能力。第四，气相色谱-质谱连用技术（GC-MS）结果表明：SlARF4正向调控了叶片提取物中萜类物质（y-Elemene、β-Caryophyllene和α-humulene）含量。SlARF4基因超量表达株系抗害虫朱砂叶螨能力增强；SlARF4基因抑制表达株系抗朱砂叶螨能力减弱。
②RNA-Seq方法分析了RNAi-SlARF4转基因株系转录组的变化。RNA-Seq鉴定了398个差异表达基因，包括在RNAi株系中的275个上调表达基因和123个下调表达的基因。其中，SlTHM1基因启动子区域具有生长素作用原件AuxRE（TGTCTC）；SlMYB52基因启动子区域含有TGA作用原件（AACGAC）。凝胶阻滞（EMSA），双荧光素酶和免疫共沉淀（ChIP）实验表明：SlARF4结合SlTHM1和SlMYB52基因的启动子并且抑制了他们的表达。杂交实验结果表明：SlARF4依赖SlTHM1和SlMYB52基因发挥对表皮毛的调控作用。
③SlTHM1基因在番茄各组织中均有表达，在表皮毛组织中表达水平最高。GUS启动子染色表明：SlTHM1基因在叶片表面Ⅱ型，Ⅵ型表皮毛组织中表达，在V型表皮毛中不表达。SlTHM1定位在细胞核中，并具有转录激活活性。番茄中，抑制表达SlTHM1基因可特异性增加Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛密度，表皮细胞密度，Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛和表皮细胞的比值以及番茄植株对生长素的响应能力。抑制表达SlTHM1基因还增强了萜类物质的含量和番茄植株对朱砂叶螨的抗性。SlMYB52基因在番茄各组织中均有表达。GUS启动子染色表明：SlMYB52基因在叶片表面V型表皮毛组织中特异性表达，在其他类型表皮毛中不表达。SlMYB52定位在细胞核中。番茄中，抑制表达SlMYB52基因可特异性增加V型表皮毛密度，表皮细胞密度，V型表皮毛和表皮细胞的比值以及番茄植株对生长素的响应能力。抑制表达SlMYB52基因不改变番茄植株对朱砂叶螨的抗性。
④SlCycB2是B类型细胞周期蛋白，在表皮毛的形成、萜类物质代谢以及植株抗逆性中发挥了关键作用。EMSA和双荧光素酶的实验结果表明：SlTHM1和SlMYB52可结合SlCycB2基因启动子并激活了它的表达。SlIAA15基因敲除突变体中Ⅱ型、V型和Ⅵ型表皮毛的密度极显著高于野生型。EMSA和双荧光素酶的实验结果表明：SlTHM1和SlMYB52可结合SlIAA15基因启动子并激活了其表达。
综上所述，R2R3MYB生长素信号转导通路在调控番茄表皮毛叶片形成发育过程中发挥了重要作用。生长素诱导SlARF4基因表达，SlARF4蛋白抑制了下游SlTHM1和SlMYB52基因表达。SlTHM1和SlMYB52通过调控下游基因SlCycB2和SlIAA15分别调控了番茄叶片表面多细胞和单细胞表皮毛的形成。Ⅱ型和Ⅵ型表皮毛密度增加增强了番茄植株对朱砂叶螨的抗性，为使用基因工程手段增强植物抗生物胁迫能力提供了新的策略。