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第一部分:MiR-124通过STAT3/HIF-1信号通路逆转乳腺癌干细胞对多索鲁比素的耐药性目的:探究MiR-124通过STAT3/HIF-1信号通路逆转乳腺癌干细胞对多索鲁比素的耐药性。方法:基于GPL571,使用GSE24460进行微阵列分析,以确定乳腺癌干细胞多药耐药基因中mRNA的表达差异。GSE24460中分为两组,包括2个亲本对照组和2个MCF7细胞耐药组。收集MCF7细胞,并酶解成单细胞悬液。MicroRNA-124模拟物和非特异性miRNA对照由GenePharma(中国上海)合成。STAT3 siRNA和对照siRNA购自赛默飞世尔科技公司(美国)。pcDNA3.1-STAT3质粒来自GenePharma。使用Lipofectamine TM 2000(Invitrogen Co.,卡尔斯巴德,CA)根据产品说明进行转染。通过MTT测定细胞活力。含有推定的miR-124结合位点的STAT3 3’UTR通过TargetScan(www.targetscan.org)进行分析,并将该miRNA位点插入萤光素酶基因(Promega,美国)的下游并转染,测定萤光素酶活性。免疫印迹法检测STAT3、ALDH1、SOX2、OCT4、HIF-1α表达。实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析STAT3、miR-124的表达。流式细胞仪凋亡检测细胞凋亡;收集细胞后消化细胞悬浮液,细胞在4℃下用75%乙醇固定4小时后将细胞与含有碘化物(PI,40%,Sigma-Aldrich)的RNA酶一起孵育,使用FACS Calibur检测细胞周期。Transwell法分析细胞侵袭能力以验证耐药性。结果:STAT3在MCF7-R细胞中的表达高于MCF7细胞系,并且影响了乳腺癌干细胞对多索鲁比素的耐药性,miR-124通过靶向STAT3以控制HIF-1信号通路,逆转了乳腺癌干细胞对多索鲁比素的抗性。结论:通过控制miR-124表达水平,抑制STAT3/HIF-1信号通路,可能成为攻克乳腺癌耐药的的新策略。第二部分:雌二醇通过Shh-Gli通路影响乳腺癌干细胞多索鲁比素耐药和糖酵解的机制目的:本研究旨在探讨雌二醇通过Shh-Gli通路影响乳腺癌干细胞多索鲁比素耐药和糖酵解的机制。方法:获取MCF-7乳腺BCSC后,通过加入1.0mg/l阿霉素霉素来维持细胞系MCF-7/ADR(M/A)的耐药性。实验前两周,将MCF-7/ADR(M/A)细胞培养在不含阿霉素霉素的培养基中。实验分为3组MCF-7/ADR组(MCF-7/ADR细胞系,未处理);Gli mimic组(MCF-7/ADR细胞系+经Gli mimic质粒转染,Gli超表达);Sh-Gli转染组(MCF-7/ADR细胞系+经Sh-Gli质粒转染,Gli低表达)。通过MTT检测细胞存活率;使用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA,RT-PCR检测Shh和Gli mRNA含量;转染48小时后,将每组细胞消化,通过Transwell检测细胞迁移;通过蛋白质印迹分析Akt、GLUT1和HK-2蛋白质含量;通过酶联免疫吸附实验检测乳腺癌干细胞HIF-1α和LDHA水平。使用核磁共振和气相色谱-质谱两种不同的技术进行细胞乳酸积累的定量。结果:与对照组相比,雌二醇处理组3小时、6小时、12小时和24小时细胞增殖速率增加,与雌二醇处理组相比,雌二醇+多索鲁比素组3小时、6小时、12小时和24小时细胞增殖速率降低(P<0.05)。与对照组(0.83±0.12,0.74±0.23)相比,雌二醇处理组Shh(5.74±0.86)和Gli(6.63±0.45mRNA水平增加,与雌二醇处理组相比,雌二醇+多索鲁比素组Shh(3.13±0.15)和Gli(4.28±0.16)mRNA水平降低(P<0.05)。与MCF-7/ADR组相比,Gli mimic组Gli表达升高,细胞增殖和细胞迁移增加(P<0.05)。Sh-Gli转染组Gli表达降低,细胞增殖和细胞迁移减少(P<0.05)。与MCF-7/ADR组相比,Gli mimic组p-AKT、GLUT1和HK2表达升高(P<0.05)。Sh-Gli转染组p-AKT、GLUT1和HK2表达降低(P<0.05)。与MCF-7/ADR组相比,Gli mimic组HIF-1α、LDHA和乳酸水平升高(P<0.05)。Sh-Gli转染组HIF-1α、LDHA和乳酸水平降低(P<0.05)。结论:MCF7/ADR细胞的有氧糖酵解表型增加,并且通过Shh-Gli信号传导对p-AKT、GLUT1、HK2、LDHA和HIF-1α的调节可能归因于多索鲁比素耐药细胞中糖酵解代谢的改变。