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背景循环DNA（circulating DNA），又称为游离DNA（cell-free DNA），是存在于血液（血浆或血清）、脑脊液以及滑膜液等体液中的细胞外DNA。随着微量DNA定量检测技术的飞速发展，循环DNA，特别是血液循环DNA，作为一种微创检查中的生物大分子标志物，日益受到人们的关注。人血液循环DNA含量的变化在多种类型疾病的诊断、疗效观察和预后判断中具有重要价值。然而，由于血液采集、分离、保存方式和样本选择的不同，以及循环DNA提取、纯化和定量方法的差异，各研究结果间缺乏可比性，目前关于健康人血液循环DNA水平和正常参考值范围，尚未见大样本的研究报道。目的建立含有内参照物的血液循环DNA定量检测方法，对健康人血液循环DNA水平进行初步研究，确定其正常参考值范围。方法自行设计并合成人工双链DNA片段，重组到pMD18-T质粒载体中，经基因克隆和多步筛选实验，构建重组质粒，提取质粒DNA，紫外分光光度法对其进行定量，梯度稀释获得标准内参照物。通过比较四种不同的DNA提取方法对重组质粒DNA的提取效率，选择合适的血液循环DNA提取方法。采用实时荧光定量PCR技术，以三条引物（共用一条下游引物）和两条Taqman荧光探针，同时扩增血浆和血清中的目的基因（人看家基因β-actin）和内参照物（重组质粒DNA），以扩增效率为指标，确定双重实时荧光定量PCR反应中的最佳Mg2+和下游引物的浓度。由已知的标准内参照物浓度计算得到目的基因的浓度。针对不同的血浆血清用量（200、100、50、10、2和1μl）进行定量检测，确定该方法的敏感性。以紫外分光光度法定量的人基因组DNA投入空白血浆和血清中，以双重实时荧光定量PCR进行定量检测，确定其准确性。针对不同程度稀释的血浆血清DNA样品进行定量检测，确定检测方法的稳定性，并对该检测方法的重复性进行评价。以建立的方法对100例健康人血浆扣血清DNA水平进行定量检测，分析其与性别、年龄、血细胞计数等的相关性，并确定正常参考值范围。结果构建了含有人工DNA片段的重组质粒DNA，经测序鉴定，与人基因组无同源性。在QIAgene、OMEGA和磁珠法DNA提取试剂盒，以及酚／氯仿法这四种DNA提取方法中，磁珠法具有最高的提取效率（71.4％）和最低的批内CV值（26％）。建立的双重实时荧光定量PCR检测方法，可在同一个反应管中同时针对目的基因β-actin和内参照物质粒DNA进行扩增，产物大小分别为91bp和99bp，分别采用以JOE和FAM荧光素进行标记的Taqman探针，可很好的区分两种产物。通过调整PCR反应体系中Mg2+浓度（6 mmol／L）和下游引物的浓度（700 nmol／L），使β-actin基因和重组质粒DNA的扩增效率分别达到99.8％和90.1％。该方法最低可对2μl血浆或血清样本进行定量测定。血浆DNA定量检测结果与紫外分光光度法比较，检测差异低于20％；血清检测差异低于30％。对于不同稀释程度的血浆血清DNA样品（分别稀释为原浓度的50％、10％和1％），定量检测结果与未稀释DNA样品的差异无统计学意义（P＜0.05）。对血液循环DNA定量检测的批内差异为11％，批间差异为17％。100例健康人血浆和血清DNA含量均呈正偏态分布，其中值水平分别为35 ng／ml和283 ng／ml（四分位数间距分别为24 ng／ml和308 ng／ml），两者差异具有统计学意义，P值小于0.001。血浆与血清DNA含量之间存在正相关关系，相关系数r为0.52，P值小于0.001。血浆血清DNA含量无性别差异及年龄相关性，与白细胞计数无相关性。按照95％的参考值范围计算，正常成年人血浆和血清DNA含量分别不超过98 ng／ml和不超过1．8μg／ml。结论本研究建立了带有内参照物的双重实时荧光定量PCR人血液循环DNA定量检测方法。该方法特异性强、敏感性和准确性高、重复性好，检测准确性受各种干扰因素的影响较小，使用微量血浆血清样本或经稀释后的DNA样品，仍能得到较准确的检测结果，因此本法可能具有临床应用价值。血浆样本比血清样本更适合用于血液循环DNA的定量检测。