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目的:建立布鲁氏菌侵染巨噬细胞模型,比较4株羊种布鲁氏菌变异株对巨噬细胞侵袭能力及胞内生存能力,比较4株羊种布鲁氏菌变异株的脂多糖特点及其遗传学变化。方法:建立强毒菌株羊种布鲁氏菌16M和弱毒菌株羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞模型,以PBS处理组作为对照,用ELISA法测量侵染后4、8、24h细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-12的表达水平;通过涂平板计数测量侵染后2、4、8、24和48h巨噬细胞内的布鲁氏菌的数量变化,绘制布鲁氏菌巨噬细胞内生存曲线,比较羊种布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5在巨噬细胞内存活能力的差异,建立布鲁氏菌在巨噬细胞内的生存曲线模型。用4株羊种布鲁氏菌变异菌株2014186、2014035、2015031、2015033及犬种布鲁氏菌RM6/66共5株菌分别染小鼠巨噬细胞RAW264.7,绘制其在细胞内的生长曲线,比较变异菌株在巨噬细胞内生存能力的变化。用酚水法和试剂盒法分别提取羊种布鲁氏菌标准株16M的脂多糖,以商品化的脂多糖标准品(提取自EscherichiaColi)作为对照,对提取的脂多糖通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染比较其纯度和结构的异同。通过鲎试剂凝集试验检测提取的脂多糖活性,并从操作过程、安全程度等方面比较两种脂多糖提取方法的特点。用试剂盒法对4株布鲁氏菌变异株提取脂多糖,并与光滑型和粗糙型布鲁氏菌的脂多糖结构进行比较,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染分析其结构的差异。用IlluminaHiSeq对4株变异菌株进行全基因组测序,对21个参与布鲁氏菌脂多糖合成的基因(17个基因位于Ⅰ号染色体上,4个基因位于Ⅱ号染色体上)用BLAST软件进行序列比对,分析基因序列的改变及其引起的相应基因产物的变化(以布鲁氏菌标准株16M作为参考,其序列来自GenBank,结合各基因的功能分析其变化对脂多糖合成的可能影响。结果:1.在侵染后4小时,16M和M5侵染组的IL-1β和IL-6的产生水平具有统计学意义。在各时间点上两组的IL-12均无明显变化。2.在各时间点上,巨噬细胞内16M的数量均高于M5,且随着时间推移二者的差距逐渐增加。3.四株变异布鲁氏菌经三胜黄素凝集试验和吖啶黄凝集试验发现其变异程度并不完全相同,035和033与两种试剂均发生明显的凝集反应,其凝集水平和粗糙犬种菌基本一致,而186和031两株菌则仅与丫啶黄素发生较弱的凝集反应,和三胜黄素几乎不发生凝集反应。4.侵染后2小时,粗糙型菌株033、035侵入数量高于光滑型菌株16M。031和186两菌株侵入数量和]6M相近。5.侵染后48小时,033、035、186三个菌株在细胞内的数量和16M比较接近,而031菌株的数量和M5接近。6.酚水法和试剂盒法提取的LPS相比,在分子量为17kDa及26kDa处存在明显的缺失。两种方法提取的LPS中经考马斯亮蓝染色均未显示蛋白条带,LPS纯度较高。7.酚水法需要细菌量大,一般需要50g湿菌,试剂盒法需要菌量少,2 ml(菌悬液即可提取LPS。8.酚水法提取脂多糖必须提前对布鲁氏菌灭活以保证安全,试剂盒法所需菌量少,且在生物安全柜内操作,不需要提前灭活细菌。9.酚水法实验操作复杂,至少需要4天时间,试剂盒法操作简单,需要一小时即可完成。10.酚水法提取的脂多糖纯度较高,但会损失部分小分子量的LPS,试剂盒法提取的脂多糖更完整。11.两种方法提取的布鲁氏菌16M的LPS的鲎试剂凝集活性没有明显差别,均在5 EU/ng左右,而LPS标准品的凝集活性只有3.325 EU/ng。12.033和035两菌株的脂多糖条带更接近于RM6/66,条带主要分布在17 kDa附近。13.186和031两菌株的脂多糖在结构上和光滑型布鲁氏菌更相近,除在17kDa附近有条带分布外,在34-43kDa,55-95kDa及180kDa这3个分子量附近也有明显的条带分布。14.在21个脂多糖合成相关基因中,有7个基因在四株变异菌株中菌未发生突变。wbk-E和manA两个基因仅发生同义突变。大多数基因发生了一个或几个核苷酸的错义突变。四株变异布鲁氏菌中存在较多的相同的点突变。15.有两株变异布鲁氏菌存在特有的基因突变:在033菌株检测到wzt基因发生点突变,引起编码氨基酸的改变,该基因参与编码布鲁氏菌ABC转运系统,其变异影响O侧链从细胞内向外膜的转运。在035菌株,检测到在manBcore基因第1334个核苷酸处插入了一段长度为27 bp的核苷酸序列引起移码突变,该基因突变可能影响脂多糖核心寡糖成分的合成。结论:1.不同毒力布鲁氏菌在巨噬细胞内的存活能力具有明显差别,可能作为体外检测布鲁氏菌毒力的方法,但需要更多的菌株进行验证。2.16M和M5对巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和IL-12的影响差别较小,虽然部分结果有统计学意义,但不能用作布鲁氏菌毒力强弱的判断指标。3.试剂盒法提取布鲁氏菌脂多糖更简便、安全性高、成分更加完整。4.布鲁氏菌光滑型向粗糙型的变异,提高了感染早期布鲁氏菌侵入细胞的能力。5.布鲁氏菌LPS合成相关基因变异性较大,不同的粗糙型变异株可能存在不同的变异机制。6.maBcore和wzt基因对维持布鲁氏菌LPS的完整具有重要作用,该基因突变可能会导致粗糙型变异。