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目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是儿童和青少年最常见的骨原发恶性肿瘤,虽然得益于新辅助化疗以及手术技术的进步,患者的生存率有所提高,但5年生存率仍偏低,骨肉瘤患者最常出现转移的部位是肺,且90%以上的患者死亡与转移有关。由于骨肉瘤患者年龄小,预后差,对于一个家庭的打击可以说是毁灭性的,因而对于骨肉瘤转移相关的研究具有重大意义。转移是一个复杂的过程,细胞从原发肿瘤脱离,穿过细胞外基质和静脉,进入血液循环,在远处渗出,并定植在新的部位开始新的扩张过程。虽然新辅助化疗的实施使骨肉瘤患者的预后改善,然而骨肉瘤转移患者由于化疗耐药性的产生,其五年生存率仍不足20%。近年研究发现,T细胞、肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞在肿瘤侵袭迁移的过程中发挥着重要作用,免疫治疗有望成为治疗骨肉瘤肺转移的重要手段和新突破口。人体的大多数单核细胞都是经典单核细胞（Classical monocytes）,又叫炎性单核细胞（Inflammatory monocytes,IMO）,大约占单核细胞的80%-90%,当它们被招募到感染部位时,会吞食细菌、病毒和死亡细胞,分泌各种促炎细胞因子,并招募其他免疫细胞来调节炎症反应。大约10%-25%是非经典单核细胞（Nonclassical monocytes）,又叫巡逻单核细胞（Patrolling monocytes,PMO）,他们可以逆血流而行,清除病原体和其他有害细胞。PMO通过CX3CR1/CX3CL1可以感知肿瘤细胞,向它们移动,帮助协调杀死它们,并在癌细胞转移之前清除肿瘤细胞的碎片。2015年Hanna等人发表于Science的研究发现,PMO具有抑制黑色素瘤肺转移的作用,其主要通过募集NK细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用,为肿瘤转移的治疗提供了新的思路。PMO作为免疫细胞,是否影响骨肉瘤细胞肺转移未见报道。本研究通过生物信息学方法筛查可能影响骨肉瘤肺转移的免疫细胞,探讨不同种类单核细胞对于骨肉瘤肺转移的影响以及潜在的影响机制,结合体内体外实验进行研究验证,可能对于骨肉瘤肺转移的治疗提供新的有效策略。研究方法:1、生物信息学分析本研究选取骨肉瘤作为研究对象,通过生物信息学技术分析影响骨肉瘤转移的免疫细胞浸润情况,首先根据GEO dataset中下载骨肉瘤转移相关的单细胞测序数据GSE152048对细胞质量进行筛选,阐述单细胞间的关系并结合已发表的文献,对细胞群进行注释。根据GEO dataset数据库中的高通量基因表达数据GSE21257,通过CIBERSORT算法分析骨肉瘤微环境中22种浸润免疫细胞的浸润水平,通过生物信息学分析影响骨肉瘤化疗后免疫细胞浸润情况,考察单核细胞与骨肉瘤发生转移及预后的相关性。2、体内实验利用氯磷酸盐清除剂清除裸鼠体内单核细胞,制作裸鼠单核细胞缺乏的动物模型,利用分流式选得到的人IMO和PMO,分别与骨肉瘤MG-63细胞共同注射至裸鼠体内,验证两种不同单核细胞对骨肉瘤转移的作用。3、体外实验进一步通过生物信息学技术方法筛选单核细胞发挥作用的通路。利用流式分选技术,分别获得IMO和PMO,分别与骨肉瘤细胞MG-63、Saos-2体外共培养,利用划痕实验、Transwell迁移、侵袭实验、增殖实验对比不同单核细胞类型对骨肉瘤细胞的影响差异。组织免疫荧光检查不同组织标本中单核细胞的浸润差异,Western检测IMO和PMO与骨肉瘤细胞共培养后相关通路蛋白表达水平。结果:1、单核细胞在骨肉瘤肺转移过程中发挥重要作用通过单细胞测序结果发现,骨肉瘤组织中存在丰富的以髓样细胞为主的免疫细胞浸润,且在转移和原发骨肉瘤中免疫细胞浸润存在巨大差异,其髓样细胞、肥大细胞、B细胞比例明显下降。CIBERSORT算法分析发现,骨肉瘤化疗后组织中免疫细胞的比例差异明显,其中单核细胞在未发生转移的骨肉瘤组织中相对占比较高。且高浸润单核细胞的骨肉瘤患者总生存期较长;此外高浸润单核细胞、肥大细胞和滤泡辅助性T细胞的患者化疗效果更好。2、体内实验研究证明,在清除单核细胞的裸鼠,尾静脉注射给予骨肉瘤细胞和PMO,其肺部转移灶数目明显少于尾静脉注射给予骨肉瘤细胞和IMO的裸鼠;组织免疫荧光实验发现,在未发生转移的骨肉瘤组织中PMO细胞浸润程度高于转移组织骨肉瘤组织。3、PMO可抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭能力单核细胞和骨肉瘤MG-63细胞共培养,经划痕、Transwell迁移、侵袭实验证实PMO可抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭能力,而IMO则促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。单核细胞可能通过MAPK/JNK信号通路调控骨肉瘤细胞的转移单核细胞和骨肉瘤MG-63细胞共培养,进一步通过Western Blot方法分析,巡逻单核细胞可通过抑制骨肉瘤MG-63细胞MAPK/JNK信号通路蛋白JNK1的表达,PMO和骨肉瘤MG-63细胞共培养后,E-cadherin水平上调（p<0.01）,D-cadherin水平下调（p<0.01）,Vimentin水平下调（p<0.0001）。而IMO则可上调MAPK/JNK信号通路蛋白的表达,经典单核细胞和MG-63细胞共培养后,E-cadherin水平下调（p<0.01）,D-cadherin水平上调（p<0.01）,Vimentin水平上调。结论:1.本研究基于基因芯片分析和生物信息学方法组合,证明高浸润单核细胞的骨肉瘤患者预后较好、生存时间长,提示单核细胞可能具有抑制骨肉瘤细胞肺转移的作用。2.PMO易浸润在未发生转移骨肉瘤临床组织中,体内给予PMO可抑制骨肉瘤动物模型肺转移,作用机制可能与PMO抑制MAPK/JNK通路和EMT有关。3.PMO作为一种新型免疫细胞,具有抑制骨肉瘤肺转移作用,研究结果预期可能为骨肉瘤的免疫治疗提供新的治疗选择实验依据。