目的:本文运用代谢组学和氧化还原组学的方法研究棉酚对卵巢癌细胞SKOV3的作用，以理解棉酚诱导卵巢癌细胞凋亡的机制。　　 方法:　　 1.流式细胞分析:SKOV3细胞被均匀分入六孔板中，用不同浓度的棉酚处理24小时。然后按照收细胞，固定，加核糖核酸酶，碘化丙啶染色，流式分析的步骤进行，数据通过CELL Quest软件分析获得。　　 2.ROS检测:实验组和对照组的SKOV3细胞使用10μM的棉酚处理24小时，离心收集，并使用温的HBSS/Ca/Mg溶液润洗一次。细胞用500μL25μM的carboxy-H2DCFDA工作液重悬，37℃孵育25分钟，然后将Hoechst33342试剂加入反应体系，其终浓度为1.0μM，孵育5分钟。终产物用1ml HBSS/Ca/Mg轻柔的润洗，然后立即使用Zeiss710共聚焦显微镜拍照。　　 3.代谢组学分析:运用-80℃预冷的甲醇萃取，然后反复冻融的方法提取SKOV3细胞代谢产物。为了定量实验组和对照组中含氨基的分子，采取了直接浓缩和TMT标记两种方式，并分别使用液相质谱分析。LTQ-Orbitrap质谱仪通过X-calibur2.0.7软件生成数据，通过分析每张质谱图来寻找标记的氨基酸及相关碎片，分析细胞的代谢产物水平的变化。　　 4.巯基的区分性捕捉:SKOV3细胞使用1％的NP-40裂解液裂解，蛋白浓度通过标准的BCA法测得。在样品中加入非变性的蛋白上样缓冲液，跑非还原SDS-PAGE。棉酚处理和未处理组均按照巯基双标记法进行操作，即先用13C-碘乙酸标记游离的巯基，DTT还原后，再用12C-IAM标记结合状态的巯基，然后质谱级胰酶消化过夜，最后用50％乙腈、1％三氟乙酸萃取两次，浓缩、装样、送检。　　 将LC-MS/MS检测得到的二级质谱数据通过Mascot核心算法或者人类蛋白质发现检索算法来检索。搜索条件如下:胰蛋白酶特异性全酶解，允许2个酶切错误，将脲甲基(57.021Da)和13C-羧甲基化(60.005Da)设置为半胱氨酸可变修饰，氧化(M)同样被设置为可变修饰，离子阱色谱仪中所获得的所有一级质谱数据的质量误差为10 ppm，二级质谱数据中碎片离子的质量误差为0.5Da。搜索错误和虚假的发现率(FDR)被设置为1％。　　 结果:　　 1.流式凋亡结果:棉酚处理的SKOV3细胞比未用棉酚处理的SKOV3细胞在M1区域的细胞群体增多，同时健康细胞数量减少。通过DNA染色，发现细胞凋亡率随棉酚浓度的增加而升高。据估计，在50μM棉酚处理细胞24小时后细胞的凋亡率达到70％。　　 2.ROS检测结果:三次重复试验均表明:棉酚处理过的细胞相比于未经处理的细胞表现出更强的绿色荧光，表明棉酚处理增加了在细胞中ROS的显示，而未经处理的细胞表现出最小的荧光。　　 3.代谢组学分析结果:通过使用准确的测量质量，确定了约50代谢产物。使用TMT标签的定量检测，发现那些来自未处理细胞的样品中谷胱甘肽(GSH)，谷氨酰胺，天冬氨酸和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)这三种代谢物的浓度比未处理过的细胞低。　　 4.氧化还原状态结果:通过正反库检索，并人工比对后确定了约2000种蛋白，假阳性率估计小于1％。确认了棉酚引起356个蛋白质上545个含有半胱氨酸的肽段的巯基发生了氧化还原状态的变化。这些蛋白参与了一系列诸如细胞代谢，氧化应激，凋亡以及细胞周期调节的细胞进程。使用非定量标记分析，比较了在棉酚未处理和处理后的样品中13C-羧甲基化的肽段的强度，215个肽段的水平增加，而330个肽段减少。　　 结论:发现棉酚刺激后产生氧化应激，促使卵巢癌细胞凋亡。经过蛋白质组学分析，表明棉酚刺激使得356个蛋白中的巯基氧化还原状态产生变化。通过对HSP60和PKM2的半胱氨酸氧化还原敏感性分析，表明巯基/二硫键的比率与细胞内GSH水平有关。认为:棉酚刺激卵巢癌细胞可能是通过耗尽细胞内GSH促使癌细胞凋亡，巯基氧化还原状态的变化与糖酵解和应激反应有关。